Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ

 

Изобретение относится к способам определения активности ферментов . Цель изобретения - определение активности никотинамидньпс дегидрогеназ в гетерогенных системах путем потенциометрической регистрации изменения концентрации протонов в реакционной смеси. Регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени . Добавляют стандартное количество кислоты в случае защелачивания среды или щелочи - в случае закислення среды. Активность дегидрогеназы определяют , сравнивая сдвиги рН в Ходе реакции и при добавлении кислоты или щелочи. 1 шт., 3 табл. с . (О

СОЮЗ ССВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) д

g

1 а 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3682278/28-14 (22) 02.01.84 (46) 07.09.86. Бюл. ¹ 33

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (71) 1-й Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им.акад.И.П.Павлова (72) И.Г.Щербак и А.А.Жлоба (53) 543.866(088.8) (56) Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзнмологии. M. Высшая школа, 1980, с. 53. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

НИКОТИНАИИДНЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ (50 4 G 01 N 33/84 С 12 1/32 (57) Изобретение относится к способам определения активности ферментов. Цель изобретения — определение активности никотинамидных дегидрогеназ в гетерогенных системах путем

1 потенциометрической регистрации изменения концентрации протонов в реакционной смеси. Регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени. Добавляют стандартное количество кислоты в случае защелачивания среды или щелочи — в случае закисления среды. Активность дегидрогеназы определяют, сравнивая сцвиги рН в ходе реакции и при добавлении кислоты или .щелочи. 1 ил., 3 табл.

1255934 2 рН-метра, выходной сигнал которого поступает на самопишущий потенциометр, Оптимальный диапазон параметров рН-метра и самопишущего потенциометра должен обеспечивать отклонение пера самописца на 5-15 мм при изменении рН реакционной смеси на

0,01.

Потенциометрическая установка, 10 используемая для определения скорости окислительно-восстановительных превращений никотинамидных нуклеотидов, состоит из термостатированной. кюветы с магнитной мешалкой, рН-метра со стеклянным электродом и электродом сравнения в качестве датчика, подключенного к рН-метру,, а также самопишущего потенциометра для непрерывной регистрации сдвига рН, 20 наблюдаемого в ходе реакции, на величину 0,02-0,2 ед. рН. Начальное значение рН, при котором проводят реакцию, сожет варьировать в пределах 4,0-10,0. Общий объем реакционной смеси также может варьировать в пределах 2,5-15 мл и более, варьирование объема реакционной смеси производят, изменяя количество 9%-ного хлорида натрия.

30 Концентрацию буфера в реакцион-.. ных смесях можно варьировать в пределах 0-0,05 М в зависимости от требуемой чувствительности определения, Концентрации субстратов и никотинамидных коферментов могут быть любыми, но не менее 0,5-10

-б

-6

1 ° 10 М. При использовании предлагаемого способа для определения активности дегидрогеназ концентра4о ции субстратов и коферментов должны соответствовать оптимальным значениям. т;е. находиться в диапазоне

0,1 ° 10 -100 ° 10" М для субстратов

Изобретение относится к физической биохимии, а именно к способам определения активности ферментов.

Цель изобретения — определение активности никотинамидных дегидро геназ в гетерогенных системах за счет потенциометрической регистрации изменения концентрации протонов в реакционной смеси.

Способ осуществляется слецующим образом.

Проводят регистрацию динамики рН в ходе реакций окисления восстановления никотинамицных коферментов. сопровождающихся изменением концентрации протонов в реакционных смесях в соответствии с уравнением

+2е +2Н

НАД(Ф}

Н Д (Ф) Н.

Ф

-2е -2Н

При этом используют реакционную смесь, в которой изменение рН в ходе реакции пропорционально количеству протонов, выделяемых в реакционную смесь или поглощаемых из нее ° При этом скорость процесса, как и по спектрофотометрнческсму способу, оценивается по скорости окисления

НАД(Ф)Н (или восстановления НАД(Ф}+ )

Скорость изменения концентрации

НАД(Ф)Н или НАД(Ф) регистрируют по изменению рН реакционной смеси, имею щей калиброванную буферную емкость.

Чувствительность предлагаемого способа регистрации скорости реакций зависит от чувствительности рН реакционной смеси и высвобождения или поглощения протонов в ходе исследуемой реакции и связана с величиной буферной емкости реакционной смеси, которую предлагаемый способ позволяет варьировать в широких пределах.

Для регистрации скорости окислительно-восстановительных превращений никотинамидных нуклеотидов достаточно обеспечить такую буферную емкость реакционной смеси, при которой сдвиг рН на 0,1 ед. происходил бы под влиянием добавления в реакционную смесь 0,05-0 1 мкмоль соляной кислоты или гидроокиси натрия, что эквивалентно высвобождению или поглощению из среды такого же количества протонов. Непрерывную регистрацию измерения рН производят при помощи и 0,1 10 — 2 ° 10 для коферментов.

Пример 1. Лактатдегидрогеназная реакция освобождение протонов в среду (если реакция протекает в прямом направлении) или захват э их из среды (если реакция протекает в обратном направлении) определяется уравнением

Молочная кислота + НАД пировиноградная кислота + НАДН + Н

В соответствии с этим уравнением в прямой реакции можно наблюдать восстановление НАД и высвобождение в среду эквимолярного количества протонов. В обратной реакции проис1255

3 ходит окисление НАДН и захват из среды протонов в состав молекулы молочной кислоты. Равновесие этой реакции резко сдвинуто в сторону окисления НАЦН, т.е. в сторону обра- зования молочной кислоты. Поэтому для определения активности лактатдегидрогеназы предпочтительнее поль зоваться реакционной смесью, содержащей исходно пируват и НАДН ° а не 10 лактат и НАД

Реакционная смесь имеет сос-. тав, приведенный в табл. 1.

Потенциометрический анализ реакционной смеси проводят в следующем 15 порядке:

1. В термостатированную при 37 С кювету объемом 4,0 мл приливают дистиллированную воду и промывают находящиеся в кювете электроды, включая 20 магнитную мешалку. После промывания электродов воду удаляют.

2 ° Вносят в кювету реакционную смесь (компонент 1 — 4, табл. 1) и погружают электродную пару так, 25 чтобы не было препятствий перемешиванию содержимого кюветы магнитной . мешалкой.

3. Производят запись изменения рН в реакционной смеси при помощи 30 согласованного с рН-метром самопишущего потенциометра.

На чертеже приведена кривая изменения рН при лактатдегидрогеназной реакции окисления НАДН, где а момент начала регистрации рН в реакционной смеси, состоящей из компонент 1-4 (табл. 1); S — внесение в реакционную смесь компонента 5:

0-2 — калибровка буферной емкости 40 реакционной смеси 0,01 мкмоль (0,02 мл) соляной кислоты; 1 — сдвиг пера самопишущего потенциометра, обусловленный защелачиванием реакционной смеси за счет накопления 4 продуктов реакции, взятый в пересчете на десятиминутный интервал времени, мм/мин; Н вЂ” сдвиг пера самопишущего потенциометра после быстрого внесения 0,01 мкмоль соляной кислоты; 1 — время.

Начальная скорость изменения рН соответствует участку а — о

4. Приливают компоненту 5, "запускающий" регистрируемую фермента- Ы тивную реакцию (для лактатдегидрогеназной реакции это - раствор nupysara)> и производят запись измене934 4 ния pH sa счет специфического окисления НАДН. Для этого достаточно

5-10 мин (участок 11 — 1 ).

5. Калибруют реакционную смесь, добавляя 0,02-0,1 мкмоль НС1 в

0,05-0,2 мл (скачок рН вследствие добавления кислоты обозначен моментом 5 — участок — 2 ).

6. После записи реакции и проведения калибровки реакционную смесь удаляют, кювету и электродную пару трехкратно промывают водой по и. 1.

Вычисление скорости окисления

НАДН проводят, используя данные, полученные при записи потенциометрической кривой. Скорость ферментативного окисления

НАД вычисляют по формуле

Ъ = ->-— - х — х 60 = 0,06 h/H

001 Ь

Н 10 где Ъ вЂ” активность фермента в пробе, мкмоль/ч;

h — сдвиг пера самописца за счет специфического изменения рН в ходе ферментативной реакции за 10 мин, мм.

Определение активности лактатдегидрогеназы в ходе окисления НАДН потенциометрическим способом в образце фермента дает результат, соответствующий спектрофотометрическому определению активности. Активность лактатдегидрогеназы. выявленная потенциометрическим способом, составляет 4,45+0,48 мкмоль/ч мл, по спектрофотометрическому способу 4,7+

0,62 мкмоль/ч мл.

Пример 2. Определение активности алкогольдегидрогеназы потенциометрическим способом можно осуществить, пользуясь реакционной смесью состава, представленного в (табл. 2).

Выполнение анализа проводят так . же, как и в примере 1.

В табл. 3 представлены результаты определения активности лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы.

Пример 3. При помощи потенциометрического способа BosMoKHQ определение активности дегидрогеназ в гетерогенных системах. В качестве примера реализации способа в гетерогенных системах проведена серия определений активности лактатдегидрогенаэы в реакционной смеси, Т а б л и ц а 1

Компо- Объем„ название, концентрация и нент рН вносимого компонента

2 мл 97-ного NaCl доведенного

0,1 М NaOH до рН 8,20

0,05 мл 0,05 M трис-НС1 буфера, рН 8,?О

0,2 мл 2 ° 10 M НАДН

0,55-0,05 мл препарата, содержащего неизвестное количество лактатдегидрогеназы

0,2 мл 2.10 M раствора пирувата натрия, рН 8,20

Общий объем реакционной смеси доводят водой до 3 мл

Таблица 2

Компо нент

Объем, название, концентрация и рН вносимого компонента

2 мл 9Х-ного NaC1 доведенного 1 М

Na0H до рН 8,20

0,05 мл 0,0514 М трис-НС1 буфера, рН 8,20

0,2 мл 0,01 M НАД

0,055--0,05 мл препарата, содержащего неизвестное количестве алкогольдегигдрогеназы

0,2 мл 0,02 И раствора этанола, Н

Общий объем реакционной смеси доводят водой до 3 мл

5 1255934 4 содержащей активированный уголь (один риментах, проведенных потенциометрииэ сорбеитов, применяемых при гемо- ческим способом, установлено снижесорбции). Данное исследование спект- ние активности лактатдегидрогеназы рофотометрическим способом провести с 4,45 -0.48 мкмоль/ч мл в реакционневозможно вследствие оптической н ой смеси, не с одержащей уголь, до непрозрачности реакционной смеси, 1,80 0,14 в реакционной смеси с актисодержащей взвесь угля в условиях вированным углем в качестве адсорпостоянного перемешивания..З экспе- бента (табл. 3).

1255934

Таблица 3

Активность фермента, мкмоль/ч мл

Раствор НАДН

0,7Ф 0,12

Раствор НАД+ и = 6

12, 2+0,81

n = 12

Раствор НАДН

Плазма крови человека, содержащая лактатдегидрогеназу .

4 Взвесь 100 мг активированного угля, приготовленная на растворе хлористого натрия трис НС1-буфер, рн 8,0

1,80+0,14

Раствор НАДН

1,42+0,12

Раствор НАД

n = 4

Раствор алкогольдегидрогеназы

Раствор этанола кубации фермента в реакционной смеси, содержащей буфер, субстрат-акцептор или донор электронов и никотинамидный кофермент, о т л и ч а ю щ и йСостав реакционной смеси.1 Раствор хлористого натрия трис-НС1 буфер рН 8,0

Раствор лактатдегидрогеназы

Раствор пирувата натрия

2 Раствор хлористого натрия трис-НС1 буфер, рН 8,0

Раствор лактатдегидрогеназы

Раствор молочной кислоты

3 Раствор хлористого натрия трис-НС1 буфер, рН 8,0

Раствор пирувата натрия

Раствор лактатдегидрогеназы

Раствор пирувата натрия

5 Раствор хлористого натрия трис-НС1 буфер, рН 8,0

Формула изобретения

Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ путем ин4,45+0,48

n 6

1255934

1 5, Т 7Х й,мин

//

Составитель Н. Г уляева

Техред Л.Сердюкова Корректор Т. Колб

Редактор H. Рогулич

Заказ 4816/44 Тираж 778 Подписное

ВНИИПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 с я тем, что, с целью определения в гетерогенных системах, регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени, затем добавляют стандартное количество кислоты в случае защелачивания среды или щелочи — в случае закисления среды, а активность дегидрогеназы определяют, сравнивая сдвиги рН в ходе реакции и при добавлении кислоты или щелочи.