Способ изготовления ферментативного гидролизата тканей куриного эмбриона для приготовления защитных сред при производстве сухих вирусных вакцин

 

(19)SU(11)1277457(13)A1(51)  МПК ⁵    _{A61K37/02, C12N1/00, B01F17/30}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА ТКАНЕЙ КУРИНОГО ЭМБРИОНА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЗАЩИТНЫХ СРЕД ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СУХИХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН

Изобретение относится к биологической промышленности, а именно к изготовлению сухих вирусных вакцин, и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта. П р и м е р 1. Куриные эмбрионы (12,5 кг), отделенные от скорлупы и желточных мешков, промытые раствором дезоксона, помещают в коллоидную мельницу, добавляют 12,5 л дистиллированной воды (1:1) и измельчают в течение 10-15 мин. Гомогенизированную смесь переносят в реактор, снабженный мешалкой и системой термостатирования, добавляют 1% хлороформа, а затем панкреатина (активность 45-50 ед) в количестве 2 г фермента на 1 л гомогената куриных эмбрионов (1:250), рН смеси доводят до значения 7,5-8,0 и поддерживают на этом уровне в течение всего процесса гидролиза, в случае необходимости подщелачивая 10%-ным раствором NaOH. Гидролиз ведут при температуре 38^оС и постоянном перемешивании. Заканчивают гидролиз через 20 ч при достижении в гидролизате аминного азота 5,0% , триптофана 2,0%. Гидролиз прекращают прогреванием смеси при 90^оС в течение 0,2 ч. Охлажденный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр, осветляют на сепараторе (марки типа ОМ-1) и высушивают на распылительной сушке типа "Niro-Atomirer" до массовой доли влаги не выше 6%. Выход сухого продукта 5% от массы белкового субстрата. Определяют содержание пептидных фракций, % к суммарному количеству определяемых пептидов: Высокомолекулярные (80000 - 30000) 12,0
Среднемолекулярные (30000 - 5000) 68,0
Низкомолекулярные (меньше 5000) Остальное
Методом хроматографического фракционирования молекулярную массу соединений, входящих в разные фракции гидролизата, определяют на колонках с сефадексами G 15, G 25, G 50, G 75, G 100 и G 200. Собранные фракции исследуют на спектрофотометре СФ-26. Полученный гидролизат куриных эмбрионов используют как основу защитной среды для вирус-вакцины против ньюкаслской болезни (НБ) птиц из штамма Ла-Сота. Для приготовления защитной среды берут 20 г полученного гидролизата, 20 г лактозы и растворяют в 100 мл калийфосфатного буферного раствора (рН 7,8) при нагревании (60-80^оС) и перемешивании. Защитную среду стерилизуют фильтрацией через стерилизующие пластины типа ЕКS-2, смешивают с вируссодержащей жидкостью в соотношении 1:3 (по объему). Полученную вакцину расфасовывают, замораживают и высушивают в вакууме. Стабилизирующее действие защитной среды на основе гидролизата характеризуют стабильностью биологической активности вируса в сухой вакцине при проверке ее по тесту "ускоренного старения" (7 сут при 37^оС). Величина снижения титра инфекционности вируса через 7 сут хранения при 37^оС (Δ37^оС) характеризует стабильность вакцины. Удовлетворительная сохраняемость вируса НБ, высушенного в защитной среде на основе изготовленного по предлагаемому способу гидролизата белка, подтверждена результатами длительного хранения вакцины, 6 мес при температуре 20±2^оС и 12 мес при 4-6^оС (см. табл. 1). Охлажденный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр, сепарируют на сепараторе ОМ-1 и высушивают на распылительной сушке типа "Niro Atomirer" до массовой доли влаги не выше 6% . Выход сухого продукта 4,8% от массы белкового сухого продукта. Затем определяют содержание пептидных фракций методом хроматографического фракционирования на колонках, собранные фракции исследуют на спектрофотометре СФ-26. Содержание пептидных фракций, % к суммарному количеству определяемых пептидов:
Высокомолекулярные (80000 - 30000) 10,0
Среднемолекулярные (30000-5000) 69,0
Низкомолекулярные (меньше 5000) Остальное
Полученный гидролизат куриных эмбрионов используют как основу защитной среды для вирус-вакцины против НБ птиц из штамма Ла-Сота. Для приготовления защитной среды берут 20 г полученного гидролизата, 20 г лактозы и растворяют в 100 мл калийфосфатного буферного раствора (рН 7,8) при нагревании (60-80^оС) и перемешивании. Защитную среду стерилизуют фильтрацией через стерилизующие пластины типа ЕКS-2, смешивают с вируссодержащей жидкостью 1: 3 (по объему). Полученную вакцину расфасовывают, замораживают и высушивают в вакууме. Стабилизирующее действие защитной среды на основе полученного гидролизата характеризуют стабильностью биологической активности вируса в сухой вакцине при 37,20±2 и 4^оС. Результаты, приведенные в табл. 2, подтверждают высокую эффективность полученного гидролизата в качестве основы защитной среды для высушивания вируса НБ штамма Ла-Сота. П р и м е р 2. Куриные эмбрионы (12,5 кг), освобожденные от скорлупы и желточных мешочков, промытые раствором дезоксона, помещают в коллоидную мельницу, добавляют 12,5 л дистиллированной воды (1:1), измельчают в течение 10-15 мин. Гомогенизированную смесь переносят в реактор, снабженный мешалкой и системой термостатирования, добавляют 1% хлороформа, а затем панкреатин (активность 45-50 ед) в количестве 1,92 г фермента на 1 л гомогената куриных эмбрионов (1:250), рН смеси доводят до значения 7,5-8,0 и поддерживают на этом уровне в течение всего процесса гидролиза, в случае необходимости подщелачивая 10%-ным раствором NaOH. Гидролиз ведут при температуре 39^оС и постоянном перемешивании. Заканчивают гидролиз через 29 ч при достижении в гидролизате аминного азота 7,5% , триптофана 3,0%. Гидролиз прекращают прогреванием смеси при 90^оС в течение 0,2 ч. П р и м е р 3. Куриные эмбрионы (12,5 кг), освобожденные от скорлупы и желточных мешочков, промытые раствором дезоксона, помещают в коллоидную мельницу, добавляют 18,75 л дистиллированной воды (1:1,5), измельчают в течение 10-15 мин. Гомогенизированную смесь переносят в раствор, снабженный мешалкой и системой термостатирования, добавляют 1% хлороформа и панкреатина (активность 45-50 ед) в количестве 2,08 г фермента на 1 л гомогената куриных эмбрионов (1:240), рН смеси доводят до значения 8,0 и поддерживают на этом уровне в течение всего процесса гидролиза, в случае необходимости подщелачивая 10%-ным раствором NaOH. Гидролиз ведут при температуре 37^оС и постоянном перемешивании. Заканчивают гидролиз через 18 ч при достижении в гидролизате аминного азота 3,0% , триптофана 1,0%. Гидролиз прекращают прогреванием смеси при 90^оС в течение 0,2 ч. Охлажденный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр, сепарируют на сепараторе ОМ-18, высушивают на распылительной сушке типа "Niro Atomirer" до массовой доли влаги 6%. Выход сухого продукта 5% от массы белкового субстрата. Затем определяют содержание пептидных фракций методом хроматографического фракционирования на колонках, собранные фракции исследуют на спектрофотометре СФ-26. Содержание пептидных фракций, 8% к суммарному количеству определяемых пептидов:
Высокомолекулярные (80000-30000) 15,0
Среднемолекулярные (30000-5000) 70,0
Низкомолекулярные (меньше 5000) Остальное
Полученный гидролизат куриных эмбрионов используют в качестве основы защитной среды для вирусвакцины против НБ птиц из штамма Ла-Сота. Для приготовления защитной среды берут 20 г полученного гидролизата, 20 г лактозы и растворяют в 100 мл калийфосфатного буферного раствора (рН 7,8) при нагревании (60-80^оС) и перемешивании. Защитную среду стерилизуют фильтрацией через стерилизующие пластины типа ЕКS-2, смешивают с вируссодержащей жидкостью 1: 3 (по объему). Полученную вакцину расфасовывают, замораживают и высушивают в вакууме. Стабилизирующее действие защитной среды на основе полученного гидролизата характеризуют стабильностью активности вируса в сухой вакцине при 37, 20±2 и 4^оС. Результаты, приведенные в табл. 3, подтверждают высокую эффективность полученного гидролизата в качестве основы защитной среды для высушивания вируса НБ штамма Ла-Сота. Предлагаемый способ обеспечивает сокращение объемов производства при проведении гидролиза. В известном способе на 1 л воды берут 3-4 эмбриона (масса одного эмбриона не превышает 10 г), в предлагаемом способе на 1 л воды берут 100 эмбрионов (1 кг эмбрионов). Учитывая, что выход сухого вещества в жидком гидролизате не превышает 5% от исходного объема, для того, чтобы получить 1 кг сухого гидролизата, требуется высушить по предлагаемому способу 20 л жидкого гидролизата, а по известному способу 500 л. Освобождение эмбрионов от скорлупы и желточного мешка перед гидролизом позволяет избежать повышения содержания ионов кальция в гидролизате, присутствие которых нежелательно, так как оно приводит к неконтролируемому влиянию на вирусные частицы при введении гидролизата в состав защищенной среды и к образованию осадка с солями фосфора, а также липидов, перекисное окисление которых приводит к снижению биологической активности вирусных вакцин в процессе длительного хранения. В лабораторных условиях проведен гидролиз, описываемый в известном способе, при использовании панкреатина с активностью 45-50 ед. В табл. 4 приведены результаты испытаний, а в табл. 5 приведена сохраняемость биологической активности вируса НБ в сухой вакцине. Данные, приведенные в табл. 4, наглядно подтверждают высокое стабилизирующее действие гидролизата белка, полученного по предлагаемому способу. Высушивание гидролизата улучшает условия хранения и транспортировки получаемого гидролизата и облегчает его использование при составлении защитной среды. Изготовление защитной среды на основе гидролизата куриных эмбрионов, ранее использованных для культивирования вируса, позволяет создать замкнутый, безотходный цикл производства эмбриональных вакцин, например, вакцины против ньюкаслской болезни.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА ТКАНЕЙ КУРИНОГО ЭМБРИОНА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЗАЩИТНЫХ СРЕД ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СУХИХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН, включающий измельчение куриных эмбрионов, добавление панкреатина, проведение гидролиза и оценку качества полученного гидролизата, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, перед измельчением куриные эмбрионы освобождают от скорлупы и желточного мешка и к полученному сырью добавляют дистиллированную воду в соотношении по массе 1 : 1 - 1,5, затем проводят измельчение куриных эмбрионов и в полученный гомогенат добавляют панкреатин в соотношении по массе 240 - 260 : 1, а гидролиз ведут при 37 - 39^oС и непрерывном помешивании в течение 18 - 29 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---