Способ исследования секреторных функций нейтрофилов

 

Изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунологии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтрофилов в норме и при различной патологии . Целью изобретения является повьшшние точности исследования секреторных функций нейтрофилов человека путем культивирования выделенных из периферической крови чистых нейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или без агентов. Активацию нейтрофилов проводят путем внесения в среду 199 взвеси частиц полистирольного латекса, диаметром 1,7 мкм или взвеси частиц латекса, покрытого метакриловой кислотой с диаметром 1,0 мкм. Затем клеточную взвесь центрифугируют, супернатант активированных и неактивированных нейтрофилов используют для изучения влияния супернатанта на активность лейкоцитов по способности их восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан, а также на лизосомальную активность, фагоцитоз моноцитов.Нейтрофилы выделяют различные вещества в супернатант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы, продуцируют вещества, резко усиливающие функции моноцитов. i (/

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (59 4 0 О1 И 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3906575/28-14 (22) 06.06.85 (46) 30.01.87. Бюл. Ф 4 (71 ) Челябинский государственный медицинский институт (72) И.И,Долгушин, Л.Я.Эберт, А.В.Зурочка, Е.А,Крашенинникова, В.Ф.Долгушина и Л.В.Мельник (53) 616.073(088.8) (56) Won@ L. et а1, The identif ca—

tion of Ie and. C receptors on

human пец1го111я, 3. of. Immunol.

Methods, У 7, 1975, с. 69-76. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕКРЕТОРНЬ(Х ФУНКЦИЙ НЕ1ПРОФИЛОВ (57) Изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунологии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтрофилов в норме и при различной патологии. Целью изобретения является повьш)ение точности исследования секреторных функций нейтрофилов чело„„SU„» 1287006 А1 века путем культивирования выделенных из периферической крови чистых нейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или беэ агентов. Активацию нейтрофилов проводят путем внесения в среду 199 взвеси частиц полистирольного латекса. диаметром

1,7 мкм или взвеси частиц латекса, покрытого метакриловой кислотой с диаметром I 0 мкм. Затем клеточную взвесь центрифугируют, супернатант активированных и неактивированных нейтрофилов используют для изучения влияния супернатанта на активность лейкоцитов по способности их восстанавливать нитросиний тетраэолий в диформазан, а также на лиэосомальную активность, фагоцитоэ моноцитов.Нейтрофилы выделяют различные вещества в супернатант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы, продуцируют вещества, резко усиливающие функции моноцитов.

Дпя вьделения моноцитов часть мо6 нонуклеаров в концентрации 10 клеток в мл инкубировалась в течение

1 ч при 37 С в пробирках "сапожках", 45 на дне которых находились покровные стекла. Затем клетки, прилипшие к стеклу, отмывались от лимфоцитов средой 199 и использовались для изучения влияния супернатантов активи- 50 рованных и неактивированных нейтрофилов на лизосомальную активность, фагоцитоэ моноцитов и способность последних восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ) в диформазан. Вторая часть мононуклеарных клеток, не помещенных в сапожки доводилась до, концентрации 1 0 клеток на 1 мл и использовалась для определения

Активированных нейтрофилов М+м

1,346+0,044

13 (0,001

0,671+0,043

Неактивированных нейтрофилов

Изобретение относится к медици— не, точнее к клинической иммунологии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтрофилов в норме и при различной патологии.

Целью изобретения является повышение точности исследования секреторных функций нейтрофилов человека.

Поставленная цель достигается тем, что осуществляют культивирование вьделенных иэ периферической крови чистых нейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или без аген тов, центрифугируют клеточную взвесь, удаляют супернатант, с последующим использованием супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов как факторов, влияющих наактивность лейкоцитов.

П р и и е р 1. Исследовали влияние секрета нейтроАилов, выделенных иэ крови доноров, на аутологичные моноциты. Для этого гранулоциты и мононуклеары выделялись из периферической крови людей путем центрифугирования на двойном градиенте, плотность нижнего раствора фиколл- уротраст 1,093, верхнего — 1,077. На границе между растворами образовывалось кольцо гранулоцитов, между плазмой и верхним раствором фиколлуротраста-мононуклеаров. После выделения клеточные суспенэии отмывались средой !99. Морфологический контроль мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, показал, что в верхнем слое 70-75% клеток составляли лимфоциты, 10-20% — моноциты, 5-10X — гранулоциты, в нижнем кольце — 100X клеток были нейтрофилами.

87006 2 действия супернатантов нейтрофилов на хемотаксис моноцитов.

Взвесь гранулоцитов из нижнего кольца разводилась средой 199 до концентрации 5 10 клеток в 1 мл и разливалась поровну в две пробирки °

В 1-ю пробирку вносилась взвесь ча8 стиц латекса (из расчета 10 частиц

6 на каждые 5 10 нейтрофилов), во

10 вторую — такой же объем среды 199.

Пробирки с гранулоцитами инкубироо вали в течение 1 ч при 37 С. Активацию нейтрофилов определяли по изменению числа лизосом. В 1-й пробир15 ке (активированные нейтрофилы) лизосомальная активность 646,74+28,76 (n=20), во второй (неактивированные нейтрофилы) - 459,1+19,8 (n=20).

Содержимое пробирок центрифугирова20 ли при 1500 об/мин в течение !5 мин, Супернатант использовался как хемоатрактант, а также добавлялся в "сапожки" в количестве мл для оценки его влияния на фагоцитарную, лизосомальную активность моноцитов, а также на реакцию восстановления этими клетками НСТ в диформазан.

Фагоцитарная (по захвату частиц латекса) и лизосомальная (по числу лизосом) активность оценивалась по методу И.С.Фрейдлин, реакция восстановления НСТ вЂ” по количеству активных клеток, содержащих гранулы, и по индексу восстановления НСТ в диформаэан, хемотаксическая активность моноцитов исследовалась под агарозой по методу P.Ä,Íåëüñîíà и соавторов. Результаты представлены в табл. 1-3.

40 Влияние супернатанта активированных (АН) и неактивировапных (НН) нейтрофилов на хемотаксис сингенных моноцитов представлено в табл. 1.

Таблица 1

3 1287006 4

Продолжение табл.1 П р и м е ч а н и е: р — досто5 верность различий по отношению к контролю.

<0„00I Влияние супернатантов AH и НН на

0,99» 0,01 5 фагоцитарную и лизосомальную активность сингенных моноцитов представ20 лено в табл. 2 .

Контроль И+м (взвесь латекса и

Таблица 2

Вид супернатанта Статист. Интенсивность Содержание показатель фагоцитоза лизосом

Активированных нейтрофилов

329, 3+24, 64

104,5+8,65

V.+м

l0

<0,05

198,9 14,23

<0,05

42,7+2,37

Неактивированных М+м нейтрофилов

10

<0,05

0,05

153,4+5,46

Контроль (среда 1 +M

199) 253, 85 19, 24

10

П р и м е ч а н и е: р — достоверность различий по отношению к контролю.

Фагоцитоз определяли в отношении моноциты:латекс 1:20.

Таблица 3

ые ты, Активированные М+м нейтрофилы и

40,27+5,62

0,873 0,139

<0,0)

27, 09+ 4, 38

< 0,01

0,429+0,089

Неактивирован- !+и ные нейтрофилы!

Влияние супернатанта АН и НН на реакцию восстановления сингенными моноцитами нитросинего тетразолия в диформазан представлено в табл,3.

1287006

Продолжение табл.3

0,289 0 035

20, 75 2,05

Контроль

12

П р и м е ч а н и е; p — достоверность различий ло отношению к контролю.

Продолжение табл.4

0,645+0,043

Неак тивированные нейтрофилы

12 ((03 001

О, 99 0, 01

Контроль М+м

25 стиц латекса) и

Активирован- Ч+м. ные нейтрофилы и

1,542+0,119

О, 001

Таблица 5

Вид супернатанта Статист. Интенсивность Содержание показатель фагоцитоза лизосом

М+м

Активированные нейтрофилы

184,5"-20,62 4! 1, 75+13,42

8 8 (0,001

102,63118, 01 263, 5+ 21, 37

Неактивированные М+м нейтрофилы

«0,05

Контроль (среда М м

199) 165, 83 18,04 253, 82+ 19, 24

П р и м е ч а н и е: р — достоверность различий по отношению к контролю.

Фагоцитоз определяли в отношении моноциты:латекс 1:100.

Пример 2. Изучалось влияние нейтрофилов на алогенные моноциты доноров. Исследование проводилось по методике, описанной в примере 1. Результаты представлены в табл, 4-6, Влияние супернатанта АН и НН на хемотаксис аллогенных моноцитов представлено в табл. 4.

Таблица 4

П р и м е ч а н и е: р — достоверность по отношению к контролю.

Влияние супернатантов АН и НН на фагоцитарную и лизосомальную активность аллогенных моноцитов представлено в табл. 5.

1287006

Индекс восстановления нитросинего тетразолия

Активные моноциты,% показатель

Активированные нейтрофилы сО, 05

<О, 05

«0,05

0,289+0,035

20,75 2,05

Контроль (среда 199) 10

Таким образом, из полученных нами данных видно, что нейтрофилы вы30 деляют различные вещества в супернас тант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы продуцируют вещест35 ва, резко усиливающие функции моно цитов. У рожениц с послеродовой инфекцией отмечается резкое снижение способности нейтрофилов к синтезу активирующих моноциты веществ.

4р Как видно иэ представленных при меров, предлагаемый способ исследования секреторных функций нейтрофилов позволяет изучить влияние секретов активированных и неактивированных нейтрофилов на функциональную активность мононуклеаров человека как в аутологичном, так и в аллогенном сочетании, что позволяет расширить представление о функциях нейтрофилов, в частности о влиянии продуктов их секреции на активность других клеток, а главное дает новый подход к оценке ранее неизученных секреторных функций нейтрофилов человека в клинической практике.

Формула изобретения

312,3+18,144

Активирован- У+м ных нейтрофилов и

<0,01

193,64 6,02

1" 4 м

Неактивированных нейтрофилов.10

П р и м е ч а н и е: р — достоверность по отношению к контролю.

Влияние супернатантов AH и НН на реакцию восстановления нитросинего !

Вид супернатантов Статист.

Неактивированные Y м нейтрофилы

Пример 3. Изучали влияние супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов рожениц с присоединившейся послеродовой инфекцией ° Исследование проводилось .по той же системе, что и в примерах

1, 2.

Данные влияния супернатантов AH и НН рожениц с послеродовой инфекцией на активность моноцитов доноров представлены в табл. 7.

Таблица 7

Супернатант Статист. Содержание показа- лиэосом тели р <0,001

Контроль И м 410, О+5, 77 (среда 199) и 10 тетраэолия в диформазан аллогенны- ми моноцитами представлено в табл.б.

Таблица 6

39,71+ 9,22 0,727+0,165

29, 66+ 6, 94 О, 508 0, 065

Способ исследования ° секреторных функций нейтрофилов, включающий вы9 1287006 10 деление чистой популяции нейтрофилов вацию путем внесения в среду 199 из крови, культивирование нейтрофа- взвеси частиц полистирольног0 латекгов на питательной среде и исследова- са диаметром 1,7 мкм или взвеси часние свойств нейтрофилов иммунологи- тиц латекса, покрытого метакриловой ческими методами, о т л и ч а ю — — 5 кислотой с диаметром 1,0 мкм, далее шийся тем, что, с целью повьпие- проводят выделение супернатанта акния точности способа, в качестве пи- тивированных нейтрофилов и изучение тательной среды используют среду влияния супернатанта на лейкоциты

199, а при культивировании нейтрофи- проводятпо способностиих восстанавли— лов дополнительно проводят их акти- К вать интросинийтетразолий в диформазан, Составитель А.Макаров

Редактор Н,Слободяник Техред Л.Олейник Корректор M.Äåì÷èê

Заказ 7708/45 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4