Способ разделения производных белка и микроорганизмов

 

Изобретение относится к области жидкостной хроматографии и может найти применение при разделении и анализе полидисперсных систем, содержащих биополимеры и микроорганизмы. Целью изобретения является повьшение селективности разделения. Производные белка и микроорганизмы разделяют путем хроматографического анализа в присутствии гетерогенного элюента, представляющего собой перемешенные три жидкие фазы: первая фаза, обогащенная полипропиленгликолем; вторая фаза, обогащенная полиэтиленгликолем; третья фаза, обогащенная однозамещенным фосфатом калия, при следующем соотношении компонен-- тов, мас.%: полиэтиленгликоль 4000 10; полипропиленгликоль 424 12; полипропил енгликоль 1025 3; однозамещенный фосфат калия 9; хлористый натрий 0,1; вода дистиллированная остальное . 10 ил.

СО!ОЗ.СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (191 (11) (51)4 С О! m 3О/ОО

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2)) 3975597/28-13 (22) 26.08.85 (46) 30.04.87, Бюл. ¹ 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72} В,В. Помаэанов, О.А, Кононова и Е,Н. Храмов (53) 543.544(088.8) (56) Э. Дейл и др. Жидкостная колоночная хроматография. M.: Мир, 19?8, т.3. с. 315. (5Я СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

БЕЛКА И МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к области жидкостной хроматографии и может найти применение при разделении и анализе полидисперсных систем, содержащих биополимеры и микроорганизмы.

Целью изобретения является повышение селективности разделения, Производные белка и микроорганизмы разделяют путем хроматографического анализа в присутствии гетерогенного элюента, представляющего собой перемешенные три жидкие фазы: первая фаза, обогащенная полипропиленгликолем; вторая фаза, обогащенная полиэтиленгликолем; третья фаза, обогащенная однозамещенным фосфатом калия, при следующем соотношении компонен-тов, мас.7: полиэтиленгликоль 4000

10; полипропиленгликоль 424 12; полипропиленгликоль !025 3; однозамещен- а ный фосфат калия 9; хлористый натрий е

0 1 вода дистиллированная остальное. 10 нл.

1 130733

Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может найти применение при разделении и анализе полидисперсных систем, содержащих биополимеры и микроорганизмы. 5

Цель изобретения — повышение селективности разделения.

Производные белка и микроорганизмы разделяют путем хроматографического разделения их в присутствии гете, рогенного элюента, представляющего собой перемененные три жидкие фазы: первая фаза, обогащенная полипропиленгликолем: вторая фаза, обогащенная полиэтиленгликолем; третья фаза, обо- >5 гащенная однозамещенным фосфатом калия.

Увеличение количества разделяющих поверхностей соответственно приводит к увеличению селективности разделе- 20 ния, Для сравнения в классической хроматографии распределение веществ происходит между двумя фазами: неподвижный (носитель, сорбент) и подвижный (элюент) ° Согласно предлагаемому способу вещества дополнительно распределяются в гетерогенном элюенте, На фиг.! представлена хроматограмма анализа производных белка: альбумина (пик а ), дактиномицина (пик Ь), 30

L-аспарагина (пик с) и микроорганизмов Sarcina flava Ф 5 (пик С1); на фиг.2 (пик о1) — хроматограмма альбумина время удерживания 2 мин; на фиг.3 (пик 6) — хроматограмма дактиномицина, время удерживания 5 мин; на фиг,4 (пик C) — хроматограмма аспарагина, время удержания 7 мин

30 с; на фиг.5 (пик d) — хроматограмма микроорганизмов Sarcina Е1ача !! 5, 40 время, удерживания !9 мин ЗО с (условия проведения разделения оптимальные); на фиг.б и 7 — хроматограммы анализа производных белка и микроорганизмов в неоптимальных условиях; 45 на фиг.8 и 9 — хроматограммы анализа производных белка и микроорганизмов в условиях, при которых разделение не происходит; на фиг,10 — хроматограмма анализа производных белка. 50

Пример 1, Берут колонку из нержавеющей стали (9 = 250 мм„ d =

= 2,5 мм), заполняют стеклянными шариками (d = О,!2 — 0,15 мм). B качестве элюента применяют водный раст- 55 вор, состоящий из IOX полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000;

12,4Х полипропиленгликоля с молекулярным весом 425; 2,4Х полипропилен2 2 гликоля с молекулярным весом 1025;

8,5Х однозамещенного фосфата калия;

О,IX хлористого натрия; рН среды =

= 8,4. Образовавшиеся три фазы, постоянно перемешивая, подают в колонку со скоростью 0,33 мл/мин с помощью жидкостного насоса. Анализируемую дисперсную систему, содержащую аспарагин (концентрация 1 мг/мл), дактиномицин (концентрация 1 мг/мл), бычий сывороточный альбумин (конценттрация 1 мг/мл), Sarcina flava N 5 (концентрация 1,7 . 10 кл/мл) и физиологический раствор вносят в поток элюента с помощью шприца, объем вносимой пробы 12 мкл, Для регистрации разделенных компонентов применяют постколоночное окрашивание 2Х-ным флуорескамином, который готовят на ацетоне и подают в проточную кювету со скоростью 0,01 мл/мин. Флуоресценцию окрашенных веществ измеряют на спектрофлуориметре фирмы Perkin

Elmer 1000 (jl возбуждения — 390 нм, эмиссии — 505 нм ) в проточной кювете

2- 10 мм, d = 0 5 мм, имеющей .вход для непрерывной подачи красителя.

Хроматограмма разделенных производных белка и миороорганиэмов пред-, ставленна на фиг,1, Перед тем„ как анализировать диспереную систему, были получены хроматограммы каждого ее компонента. Времена удерживания отдельных веществ соответствуют временам удерживания этих же веществ при разделении дисперсной системы. Хроматограммы представлены на фиг,2 — 5.

Кроме того, элюент собирали по фракциям и для каждого отдельного случая проводили реакцию на наличие аминокислот с нингидрином, белка— реакция с биуретом, полипептида - реакция с биуретом, микроорганизмамикроскопия ° Аминокислоты в реакцию с биуретом не вступают. В трех остальных фракциях микроскопией исключали присутствие микроорганизмов, Фракции, содержащие полипептид и белок, различали только по их временам удерживания, полученным для каждого вещества отдельно, Пример 2. Условия проведения хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1, В качестве элюента применяют водный раствор, сос тоящий из 8Х полиэтиленгликоля с мо3 130733 лекулярным весом 4000; 10Х полипропиленгликоля с молекулярным весом

425; 2 . полипропиленгликоля с молекулярным весом 1025; 7 . однозамещенного фосфата калия (КН2РО ); 0,05Х хлористого натрия, остальное вода.

Хроматограмма альбумина, дактиномицина, Ь вЂ” аспарагина и Sarcina

flava N - 5 представлена на фиг,б, Пример 3, .Условия проведе- 10 ния хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1. В качестве элюента применяют водный раствор, 15 состоящий из 15Х полиэтиленгликоля с молекулярным весом (мол, в ) 4000;

15 -полипропиленгликоля с мол,в.

425; З полипропиленгликоля с мол.в.

1025; 10 однозамещенного фосфата 20 калия (КН РО ); 0,15Х хлористого натрия (NaC1); остальное вода, Хроматограмма альбумина, дактиномицина, L -аспарагина Sarcina flava

Ф 5 представлена на фиг,7, 25

Пример 4, Условия проведения хроматографического анализа, окрашивание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1. В качестве 30 элюента применяют водный раствор, состоящий из 7Х полиэтиленгликоля с мол.в. 4000; 9 полипропиленгликоля с мол.в, 425; 1 полипропиленгликоля с мол.в. 1025; б однозамещенного 35 фосфата калия (КН РО ); 0,04 хлористого натрия; вода остальное. ХроматоI грамма представлена на фиг,8, Пример 5, Условия проведения хроматографического анализа, окраши- 40 вание, регистрация и качественное определение разделенных компонентов аналогичны примеру 1. В качестве элюента применяют водный раствор, состоящий из 16Х полиэтиленгликоля с 45 мол.s. 4000; 16 полипропиленгликоля с мол,в, 425; 4 . полипропиленгликоля с мол,в, 1025; 11,0Х однозамещенного фосфата калия; 0,16Х хлористого нат рия; остальное вода, Хроматограмма 50 представлена на фиг.9.

На фиг,10 представлены хроматограмма анализа производных белка;

Предлагаемый способ может быть применен в различных областях народного хозяйства, где требуется анализ сложных смесей веществ, например в научно-исследовательских лабораториях для изучения биохимических особенностей роста микроорганизмов; в микробиологической промышленности для контроля технологического процесса; в медико-биологической промышленности для выделения биологически активных веществ из дезинтегрированной биомассы и т.д. формула и з о б р е т е н и я

Способ разделения производных белка и микроорганизмов путем хроматографического анализа их в присутствии элюента, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения селективности разделения в качестве элюента используют эмульсию, содержащую полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, однозамещенный фосфат калия, хлористый натрий и воду, при следующем соотношении компонентов, мас,Х:

Полиэтиленгликоль 4000 8-15

Полипропиленгликоль 425

Полипропиленгликоль 1025

10-15

Однозамещен-. ный фосфат калия

Хлористый натрий

Вода

7-1 0

0,05-0, 15

Остальное

2 4 альбумина (пикс ), дактиномицина (пик

j Ь), 1,- аспарагина (пик с) и микроорганизмов; E,coli 1257 (пик d) E.

coli M-17 (пик e); Serratia marcescens (пик f) Sarcina f lava Ф 5 (пик

j) °

Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с из» вестным позволяет разделять дисперс" ную систему, состоящую из аминокислоты, дипептида, белка и микроорганизмов (примеры 1-3) .

1307332 ЧУЮ

1307332

0 4 8 f8 7Е 80 24 28 мин РМХ

0 4 8 12 1Е И Г4 28 иик

pub/

1307332

0 4 8 /Г 76 ГО Г4 28 кон

0 4 8 1Г 78 ГО Л Л è

Q7uz У

Составитель И ° Борисова

Редактор С.Лисина Техред Л. Сердюкова Корректор M. Демчик

Заказ 1624/42 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул,Проектная, 4