Способ диагностики туберкулеза у детей
Изобретение относится к медицине и биохимии, предназначено для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы сыворотки в период нового реактивного состояния организма после инфицирования его микробактериями туберкулеза. Цель изобретения - повьшение точности способа путем определения общей активности изоферментов лактатдегидрогеназы с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в злектрофоретической камере , заполненной агаром и мединал-вероналовым буфером (рН 8,6 ионная сила /t 0,05) при напряжении 5 В. Затем определяют отношение активности четвертой фракции ла статдегидрогеназы к первой фракции. По увеличению относительно общей активности лактатдегидрогеназы более 10% и нарастанию соотношения активности 4-й фракции лактатдегидрогеназы к 1-й фракции более 0,4% диагностируют туберкулез. W to со
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН (51)4 G 01 N 33/68
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3289445/28-14 (22) 30.04.81 (46) 15.05.87. Бюл. Р 18 (71) Львовский научно-исследовательский институт туберкулеза (72) В.A.Íè÷èïîðóê и Ж.З.Характер (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
Р 545335, кл. А 6 1 В 10/00, 1974. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
У ДЕТЕЙ (57) Изобретение относится к медицине и биохимии, предназначено для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы сыворотки в период нового реактивного состояния организма после инфицирования его микробак„„Я0„„1310729 А1 териями туберкулеза. Цель изобретения — повышение точности способа путем определения общей активности изоферментов лактатдегидрогеназы с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в электрофоретической каме ре, заполненной агаром и мединал-вероналовым буфером (рН 8,6,ионная сила с = 0,05) при напряжении
5 В. Затем определяют отношение активности четвертой фракции ла1 татдегидрогеназы к первой фракции. По . увеличению относительно общей активности лактатдегидрогеназы более 10Х и нарастанию соотношения активности
4-й фракции лактатдегидрогеназы к
1-й фракции более 0,4Х диагностируют туберкулез.
1310729
5 мл
5,25 мг
7, 15 мг
10,0 мг
Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть использовано для изучения изоферментного спектра лактатдегидротеназы сыворотки крови в период нового реактивного состояния организма после инфицирования его микробактериями туберкулеза.
Цель изобретения — повышение точности способа за счет определения общей активности лактатдегидрогеназы и отношения активности четвертой фракции лактатдегидрогеназы к первой фракции и по значениям этих показателей диагностируют заболевание.
Способ осуществляют следующим образом.
Для получения прозрачного геля используют вымороженные сорта arapa который подвергают соответствующей обработке и чистке: 18 г агара в течение суток промывают проточной дистиллированной водой, расплавляют в 750 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и выливают в плоскую посуду тонким слоем, толщиной в 1-1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кубики размером около 1 см и вновь промывают их в течение
2-3 сут в дистиллированной воде.Затем агар разогревают и соединяют (в соотношении 1:1) с вероналмединаловым буферным раствором (рН= 8,6), добавив 0,027.-ный раствор метиолята из расчета 3-4 капли на 20-30 мл агара для предупреждения его прорастания. Полученный 1,2Х-ный агар вновь фильтруют через четырехслойный марлевый фильтр и разливают по 80-100 мл в стерильные .колбочки, которые хранятся в холодильнике при
+ 4 С.
Электрофорез белков проводят в электрофоретической камере, заполненной агаром и мединал-вероналовым буфером (рН = 8,6, ионная сила,и =
0,05), при градиенте напряжения
5 В/см и силе тока 5 NA на одно стекло. На предметные, заранее обезжиренные и фиксированные в рамках стекла наносят равномерный слой расплавленного агара (по 5 мл на каждое стекло). После того как агар застынет, специально изготовленным штампом делают в нем лунки, куда вносят по 0,02 мл негемолизированной сыворотки. Рамку со стеклами помещают в электрофоретическую камеру таким образом, чтобы лунка с нанесенной
55 сывороткой находилась ближе к аноду, Связь стекол с агаром камеры осуществляют с помощью бумажных полосок — мостиков, смоченных буферным раствором. Камеру предварительно помещают в охладительный сосуд,заполненный ледяной водой или снегом (температура в сосуде, на время прохождения электрофореза не должна превышать 5.-8 С). Крышку камеры плотно закрывают, подключают к блоку питания и устанавливают рабочий режим. Электрофорез белков проводят в течение 2-2,5 ч. Затем аппарат выключают, стекла вынимают и заливают инкубационной смесью, которую готовят непосредственно перед употреблением.
Состав инкубационной смеси:
Фосфатный буфер с ph = — 7,5 при 20 С 10 мл
Молочнокислый натрий (1M р-р)
Натрий цианистый
Магний хлористый
НАД (окисленный)
Тетразолий нитросиний . 4,2 мг
Феназинметасульфат 0,025 мг
Инкубация производится в темноте при + 37 С в течение 90-120 мин..
После инкубации агаровые блоки промывают проточной водой в течение
20 мин, а затем помещают в ванну с дистиплированной водок и промывают ,цо тех пор, пока агар не приобретет первоначальный цвет. Для лучшей отмывки электрофореграмм иногда используют 2,57.-ный раствор глицерина в 27.-ном растворе уксусной кислоты.
Затем стекла вынимают, высушивают фильтровальной бумагой и на них отчетливо определяется пять полос фиолетово-синего цвета различной интенсивности. Это и есть фракции или изоферменты лактатдегидрогеназы.
Количественная оценка активности отдельных фракций лактатдегидрогеназы производилась путем их элюирования в фосфорном буфере (ph=
7,4) с последующей фотаэлектроколориметрией. Для этого агаровые блоки, содержащие окрашенные полосы, разрезают на равные части, соответствующие расположению каждой фракции и помещают в пробирке с 3 мл фосфатного буфера. Для контроля берут аналогичные участки прозрачного (неокрашенного) агара. Затем пробир13 10
Составитель И.Емельяненко
Техред Н. Глущенко Корректор О.Тигор
Редактор А.Ревин
Заказ 1885/41 Тираж 777 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ки закрывают резиновыми пробками и ставят в водяную баню (t +80 С) на
10-15 мин.После растворения агара окрашенные в синий цвет растворы (разной интенсивности ) колориметри-руют на фэке против контроля в кюветах 5 мм при зеленом светофильтре дл Х = 610 пт. Сумму показаний экстинций всех фракций принимают за 100 и по показаниям экстинции каж- 10 дой фракции лактатдегидрогеназы высчитывают ее процентное содержание.
Отношение величины лактатдегидрогеназы-4 к величине лактатдегидрогеназы-1 является показателем коэффици- 15 ента лактатдегидрогеназы-4 /лактатдегидрогеназе-1.
Пример 1. Ребенок К. 7 лет.
Тематическая карта Ф 41.
При постановке туберкулиновой пробы отмечен вираж туберкулиновой чувствительности. Проявлений туберкулезной интоксикации и изменений в бронхолегочной системе не выявлено.
При электрофоретическом определении активности изоферментов лактатдегидрогеназы активность четвертой Аракции составила 12 от общей активности фермента, а коэффициент соотноше- 30 ния активности четвертой фракции к первой равен 0,6. На обзорной рентгенограмме выявлен петрификат в корне легкого, что установило наличие скрытого активного процесса в момент 35 обследования.
729 4
Пример 2. Ребенок Ш. 10 лет.
Через 3 года после ревакцинации БЦЖ, реакция Манту полбжительная (20 мм).
При рентгеногиомографическом обследовании в легких видимых туберкулезных изменений не найдено. При исследовании активности лактатдегидрогеназы получены следующие результаты: активность четвертой фракции фермента от общей активности составила
15, 1Z. Коэффициент соотношения активности четвертой фракции и первой равен 0,69. Диагноз: первичное инфицирование туберкулезом.
Предлагаемый способ (по сравнению с известными) значительно повышает диагностику за счет возможности выявления скрытой активности туберкулезного процесса виражных детей, которую нельзя определить ни клиникорентгенологическими, ни другими лабораторными методами исследования.
Формула изобретения
Способ диагностики туберкулеза у детей путем определения активности изоферментов лактатдегидрогеназы с помощью электрофореза, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, по увеличению относительно общей активности лактатдегидрогенаэы более 10Х и нарастанию соотношения активности четвертой фракции лактатдегидрогеназы к первой фракции более 0,47 диагностируют туберкулез.
