Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ , используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в биологии и экспериментальной медици.- не. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых юцеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела к определенному эпитопу ;ангиотензинпревра щающего фермента легких человека (АПФ). Штамм А-АСЕ-9В9 получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALE/с клетками миелоны Х63-А 8-653. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 28D Клетки культивируют на среде РРМ1-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5% COj. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Секреция моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/мл асцитической жидкости. Моноклональные антитела относятся к классу IgG( . Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкостях и т.д. 2 табл. § (Л со сд СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11> (59 4 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llo делАм изОБРетений и ОткРытий

С ;;;,, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ / З.,;"

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

"".:Ь; (21) 3996711/28-13 (22) 25. 12. 85 (46) 07. 06. 87. Бюл. У 21 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Е.Ю. Алликметс, С.М. Данилов, И.Ю. Сахаров, E.À. Духанина,И.Н. Трахт и B.Н. Смирнов (53) 578.085.23(088 ° 8) (56) Auerbach R. etc. all. Proc..

Natl. Асад. Sci. USA, 1982, 79, р. 7891-7895 ° (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК МЫШИ NUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕMbIA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩА10ЩЕМУ

ФЕРМЕНТУ ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела к определенному эпитопу ангиотензинпревращающего фермента легких человека (АПФ). Штамм А-АСЕ-9В9 получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/ñ клетками миеломы Х63-А 8-653. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 28D Клетки культивируют на среде PPMI-1640 с добавлением 10Х телячьей эмбриональной сыворотки и 10Х о лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5Х СО . Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10.

Секреция моноклональных антител на с.

3-4 день культивирования составляет

15-20 мкг/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/мп асцитической жидкости.

Моноклональные антитела относятся к классу IgG< . Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, с, .Я культивируемых клетках, биологических жидкостях и т.д. 2 табл.

Штамм А-АСЕ-9В9 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых самотических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером

ВСКК (П) !E 28 В и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования — среда ВРМ! †16 с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки и !0%-ной лошадиной

5Î! 13154

Изобретение относится к биотехнологии и может бытЬ использовано в медицине и экспериментальной биологии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, используемого для получения моноклональных антител к определенному эпитопу ангиотензинпревращающего фермента легких человека (АПФ), Штамм получают следующим образом, Мьппей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 80 мкг ангиотензинпревращающего фермента, выделенного из ткани легких человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащего

30% полного адъюванта Фрейнда. Через

10 дней иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта. Через неделю мышам вводят 60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 дня после этого 15xlO клеток селезенки т 25 иммунных мьппей гибридиэуют с 5xlO клеток миеломы мыши Х63-А88-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (объем/объем) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 3350 и 15Х диметилсульфоксида в течение 1 мин, После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели по 2xl0 клеток в лунку. Для

5 культивирования и селекции гибридов 35 используют среду RPM1-1640 с добавлением lOX-ной лошадиной и 10%-ной те@ лячьей эмбриональной сыворотки, 10 М

7 гипоксантина, 4х10 M аминонтерина и 1,6х10 M тимидина. Гибриды- проду- 40 центы клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4х10 клеток селезенки. После 2-ro клонирования практически lOOX субклонов продуцируют антитела к .ангиотензинпревращающему ферменту. Продуктивные клоны обозначают А-АСЕ-9В9.

73 2 сыворотки, 4 !пМ Ь-глютамина, 10 !и М .пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, !00 мкг/мл стрептомицнна, обога- щенная аминокислотами для базальной среды Игла, витаминами для среды Игла и 0,05 !и М меркаптоэтанола.

Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5% СО . Посевная доза

IOO.òûñ.êë./ìë, клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10.

Культура суспензионная. Штамм продуцирует антитела на протяжении 8 пассажей в культуре.

Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/ñ, обработанных пристаном, в количестве 2-5 10 кле4 ток на мьппь. Асцит образуется через

l2-16 дней. Штамм на животных не перевивают.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/

/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/

/мл асцитической жидкости.

Характеристика моноклональных антител.

Моноклональные антитела относятся к классу IgG(,. Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопом ангиотензинпревращающего фермента легких человека. Специфичность оценивается с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) и теста на "обогащение".

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культуральной среды.

Криоконсервирование. 1-5*10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида. о

Температуру снижают по.4 С в минуту до 4 С и по 1 С в минуту до -40 С.

Клетки хранят в жидкЪм азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-80Х.

Пример 1. Гибридомные клетки псмещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5xEO в 5 мл среды

КРМ1-1640 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 10%- ной лошадиной сывороткой, 4 р М глютамина, 10 р М пирувата натрия, 100 мкг/мл

4

Продолжение " àÑë. 1

0,13

1:1000

0,09

0,07

0,,08 ти из плазмы человека 0,2ный р-р БСА в

ЭФГ кая ть 50. нМ

3 l 3154 пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 р М меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5Х СО . Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800g и о

4 С. Полученный супернатант используют как реагент. для изучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензинпревращающим ферментом 10 легких человека с помощью ELISA-метода.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования собирают

АПФ вЂ” ) мкг на ячейку в 50 мкл карбонатного буфера (IOO P М, рН 9,6) о при 4 С в течение ночи. После насыщения панели О, 2Х-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения .неспецифического свя- 20 зывания антител пластиком в ячейки панели вносят 50 мкл культуральной среды штамма А-АСЕ-9В9 (на 1 ч при о

37 С). После этого панель отмывают

4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2Х-ным БСА и 0,05Х-,íûì Твин-20 и вносят конъю гат антител кролика против иммуно. глобулинов мьппи,ковалентно, связано ных с пероксидазой (на 1 ч при 37 С).

После окончания инкубации несвяэав- 30 шиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся пероксидаэу, а значит и антитела против АПФ, определяют количественно по расщеплению субстрата (Н O ) в присут- 35 ствии хромогена — ортофенилендиамина.

Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 490 нм.

Результаты опыта по изучению сне- 40 цифичности связывания иммуноглобулинов иэ культуральной среды штамма

А-АСЕ-9В9 с АПФ легких человека, сорбированном на пластике, представлены. в табл. 1 (приведено среднее из трех 45 независимых определений).

Таблица 1

Штамм "804", вырабатывающий

МкАТ против 1:10 липопротеидов низкой плотнос- 1

" Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА, то количество иммуноглобулинов из штамма А-АСЕ-9В9, сорбированных на БСА и выявленных методом

ELISA, — на уровне негативного::-.:онтроля.

Результаты, приведенные в табл. 1 ° свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма A-АСЕ-9В9, к АПФ легких человека.

Пример 2. На полистнроловую

96-ячеечную панель для микротит=:ования сорбируют антитела крол -.:а против иммуноглобулинов мыши: 100 мкл яа ячейку в концентрации 20 мкг (при 4 С о на ночь), затем после забивки глашки

0,2Х-ным раствором БСА B ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком сорбирую иммуноглобулины мыши из культурал.- ной среды от клеток штамма -ACE-989, полученной как указано в примере 1.

После отмывки панели 0,2Х-ным раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкл/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-АСŠ†9, определяют количественно в ячейках для микротитрования с помощью флуоресцен"..ного метода, используя в качестве суб-.. страта Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению спе Штамм А-АСЕ-9В9 1 цифичности взаимодействия МкАТ, вы0,70 рабатываемых клетками штамма А-АСЕ9В9 с АПФ в растворе, представлены

1:10

0,39

0,25

1:100 в табл. 2 (приведено среднее иэ трех независимых определений).

1315473

Таблица 2

7,82

6,37

2,77

0,84

0,330

0,340

0,.2é-ный БСА

ЗФР

0 324

Редактор Н. Егорова

Заказ 2316/26 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва„ Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород„ ул. Проектная, 4

Щтамм А-АСЕ-9В9 1

1:10

1: 100

1: 1000

Штамм "8С4", вы-1 рабатывающий антитела против 1:10 липопротеидов низкой ttJIoTHocти из плазмы человека .

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ-9В9 по отношению к АПФ, и показывают возможности их применения для выявления

АПФ в растворах (в биологических жидкостях, экстрактах тканей и т.д.).

10 Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus ВСКК (П)

11 28D (специализированная коллекция

15 перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР),I

1 используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека.

Составитель М. Серова

Техред А.Кравчук . Корректор Л. Патай