Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый для культивирования вирусов

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин-. Целью изобретения является получение нового диплоидного штамма кожи и мьшц эмбриона человека, используемого для культивирования вирусов. Штамм получают трипсинизацией кожно-мьшечных лоскутов 8-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования . Штамм обозначают , он хранится в Коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером 2-3-2. Время жизни штамма М-22 вне организма составляет 70 пассажей. Среднее число популяционных удвоений на 14-16 пассажах составляет 1,6 при исполь зовании сыворотки крупного рогатого скота и 1,57 при использовании сьгеоротки телят на уровне 25-28 пассажей 1,88 и 1,71. на уровне 40 пассажа 1,8 и ,72 соответственно. На уровнях 12, 20, 32 и 40 пассажей установлено , что диплоидный набор хромосом имеют 89,7; 92,0; 89,7 и 82,0% клеток соответственно. Штамм не контаминирован грибами, бактериями, микоплазмой и онкогенными вирусами. Титры вирусов при культивировании на клетках штамма М-22 имеют следующие значения: вирус полиомиелита, штамм Сэбина, типы I, II, III, 7,71 Ig БОЕ/МЛ, 7,75 Ig БОЕ/мл и 7,65 Ig БОЕ/МЛ соответственно. Титр вируса ЕСНО-11 равен Tlffljo. Титр риновируса равен 7 10 ТЦД. i (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ .

РЕСПУБЛИК (19) (11) 17021 A i

151) 4 С 12 N 5/00, 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 13,.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3892710/31-13 (22) 23. 04. 85 (46) 15.06.87. Бюл. ¹ 22 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов AMH СССР и Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им, Л.А.Тарасевича (72) Л.Л.Миронова, Н.К.Преображенская, В.П,Грачев, В.И.Стобецкий, Г.П,Крючкова, Н.M.Èâàííèêîâà, И,Г,Малыгина, В.Д.Попова, Н.М.Ральф, Г.А.Алпатова, С.Г.Дзагуров, Г,А,Ломанова, Н.В,Шалунова и M.À.Íèêîëàåâà (53) 578.085.23(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР № 764391, кл. С 12 N 7/00, 1979. (54) ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК КОЖИ И

МЫШЦ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМЫИ

ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин. Целью изобретения является получение нового диплоидного штамма кожи и мьппц эмбриона человека, используемого для культивирования вирусов. Штамм получают трипсинизацией кожно-мьппечных лоскутов 8-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования. Штамм обозначают М-22, он хранится в Коллекции клеточных культур

Института вирусологии им. Д,И.Ивановского под номером 2-3-2. Время жизни штамма M-22 вне организма составляет 70 пассажей. Среднее число популяционных удвоений на 14-16 пассажах составляет 1,6 при использовании сыворотки крупного рогатого скота и 1,57 при использовании сыворотки телят на уровне 25-28 пассажей

1,88 и 1,71. на уровне 40 пассажа

1,8 и 1,72 соответственно. На уровнях 12, 20, 32 и 40 пассажей установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7; 92,0; 89,7 и 82,0% клеток соответственно. Штамм не контаминирован грибами, бактериями, микоплазмой и онкогенными вирусами.

Титры вирусов при культивировании на клетках штамма М-22 имеют следующие значения: вирус полиомиелита, штамм Сэбина, типы I II, Ш, 7,71 1g БОЕ/мл, 7,75 1g БОЕ/мл и

7,65 1g БОЕ/мл соответственно. Титр

7,5 вируса ECHO-11 равен 10 ТЦД

ТНТр риновируса равен 7 10 ТЦД „°

1317021

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин.

Цель изобретения — получение .нового диплоидного штамма кожи и мышц эмбриона человека, используемого для культивирования вирусов и обладающе го большей пролиферативной активнос10 тью по сравнению с известным.

Штамм получают следующим образом.

Кожно-мышечные лоскуты 8-недельного эмбриона, выделенного путем аборта от здоровой женщины 32 лет, в анамнезе которой нет онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, а также гепатита и туберкулеза, промывают физиологическим раствором для удаления крови, измельчают ножницами и проводят щадящую трипсинизацию, Далее клетки ресуспендируют в среде

Игла МЕМ с 10Х-ной сывороткой крупного рогатого скота (СКРС) и эксплан- тируют в 6 полуторалитровых матрасах с концентрацией клеток 8 10 в 1 мл.

Сосуды с клетками инкубируют при

37 С. В первичной культуре монослой формируется в течение 5 сут, первый пассаж проводят на 6 сут, а все последующие — проводят по четкому графику 2 раза в неделю, так что интервал между пересевами клеток постоян/ но составляет 3 и 4 сут, Полученный штамм, обладающий морфологической и культуральной стабильностью, обозначают M-22. Штамм

M-22 хранится в Коллекции клеточных культур Института вирусологии им, Д.И.Ивановского под номером 2-3-2

40 и характеризуется следующими признаками. !

Морфологические признаки.

В фазе становления культура характеризуется неоднородностью клеточного состава и представлена фибробластоподобными и эпителиоподобными клетками. К 4-5 пассажу культура становится мономорфной и состоит из фиб- 0 робластоподобньгх клеток. Лишь .с вступлением в фазу старения вновь отмечаются клетки различной морфологии, появляются полигональные и гипертрофированные клетки.

При обследовании гистологических препаратов культур в фазе активного роста, окрашенных гематоксилин-эозином, выявляют ядро овальной или удлиненной формы, ориентированное вдоль длинной оси клеток, хроматин мелкозернистый. В цитоплазме и ядре специфических включений не наблюдается.

Электронномикроскопическое изучение штамма М-22 на уровне 28 пассажа показывает, что клетки представляют собой фибробластнь|е образования, имеющие характерное для соматических клеток позвоночных субмикроскопическое строение. В клетках хорошо развита сеть эндоплазматического ретикулума, состоящего из ппоских или расширенных цистерн, усеянных многочисленными рибосомами. Удлиненные, вытянутые вдоль длинной оси клеток, ядра содержат одно, реже два, ядрышка и диффузный хроматин. Комплекс Гольджи представлен системой плоских цистерн и многочисленными мелкими везикулами.

Округлые или овальные митохондрии

;имеют характерные для этого органоида строение. Матрикс митохондрий— более электронноплотный по сравнению с гиалоплазмой ° В цитоплазме клеток

:встречаются в умеренных количествах .липидные капли, лизосомоподобные структуры, равноразмерные вакуоли.

Клеточная поверхность относительно ровная, без многочисленных микроворсинок, Биологические признаки.

Время жизни штамма M-22 вне организма составляет 70 пассажей и складывается из трех фаз: становления на уровнях 1-3 пассажей, активного роста — на уровнях 4-39 пассажей и старения — на уровнях 40-70 пассажей.

На уровнях 14, 15 и 16 пассажей число популяционных удвоений составляет 1,61;1,68; 1,5 соответственно при использовании сыворотки крупного рогатого скота и 1,58; 1,6; 1,54 соответственно при использовании сыворотки телят.

Средняя для 14-16 пассажей в первом случае составляет 1,6, во втором — 1,57.

Время удвоения популяции при использовании обоих видов сыворотки

55 ч.

На уровнях 25-, 27, 28 пассажей число популяционных удвоений составляет l 64; 1,82; 2,2 соответственно ,с СКРС, а с сывороткой телят — 2,2;

1,57; 1,37. (при средних — 1,88 и

1,71), время удвоения популяции 48 и 53 ч соответственно, 1317021

На уровне 40 пассажа число популяционных удвоений (результаты представлены в той же последовательности) составляет 1,72 и 1,8, а время удвоения популяции 56 и 53 ч.

На уровне 50 пассажа число популяционных удвоений при использовании обоих видов сыворотки составляет

0,76, а время удвоения популяции 91 ч.

При субкультинировании клетки от стекла отделяют 0,25% раствором трипсина. Коэффициент рассева клеток н фазе активного роста составляет

1:2 — !:3.

Среда культивирования: среда Игла

МЕМ с 10% CKPC или сыворотки телят.

Кариологические признаки.

При анализе 4000 метафаз по

1000 метафаз на уровнях 12, 20, 32, 40 пассажей, установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7;

92,0; 89,7; 82,0% метафаз соответственно. Полиплоидные метафазы составляют 1,0; 2 3; 1,7; 1,6%, гипоплоидные 9,2; 5,3; 6,9; 4,7%, гиперплоидные — О,1; 0,49 0,2; 0,1%, разрывы — 0,3; 0,5; 0,2; 0,2%, пробелы — 1,7; 0,5; 1,3; 0,3% — в той же последовательности.

Сведения о контаминации штамма, 30

При обследовании клеток штамма

M-22 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровнях 10, 20, 24, 30, 33, 40 и 42 пассажей.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях

10, 20, 30 и 40 пассажей в чувствительных клеточньгл системах, а также в реакциях гемадсорбции не отмечено

40 наличие вирусов — контаминатов, I

При обследовании клеток штамма

М-22 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и сосунках белых . мьппей, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах,иммунодепрессированных мьппах линии СВА посторонних агентов не выявлено.

Онкогенная активность клеток штамма M-22 не выявлена и в опытах

in vitro в органной культуре куриного эмбриона.

Изозимный спектр.

Изучение изоферментов в клетках линии M-22 выявляет энзимограмму человека и Г6 ФДГ медленного типа.

Криоконсервация клеток.

Клетки штамма М 22 сохраняют жизнеспособность порядка 70% при консервировании в жидком азоте. Создан банк отконтролированных посевных клеток на уровне — 9 пассажа в количестве 157 ампул (по 6 миллионов клеток н каждой ампуле), Чувствительность к вирусам, Штамм М-22 чувствителен к заражению накцинными штаммами Сэбина вируса полиомиелита, Так титр типа 1 на уровне 16 пассажа равен 7,74 1g

БОЕ/мл, а на уровне 20 пассажа—

7,71, соответствующие показатели для

Птипа 7,60 и 7,75, а для III типа—

7,63 и 7,65.

Штамм М-22 чувствителен также к заражению вирусами из группы ECHO

Коксаки, рино. В частности, титр вируса ЕСН0-11 ранен 10 ТПЩ,, а рино — 7х!0 Т11Д„, .

Использование штамма М-22 иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В культуральный сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека М-22 на уровне 19 пассажа вводят Oi25%-ный раст-. о нор трипсина, подогретого до 37 С.

Через 7-!0 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37 С на 2-3 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхи-. ванием, заканчивают процесс отделения клеток от стекла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста — среда Игла 1ЕМ с 10% СКРС, и разливают на два сосуда. Эти культуры 20 пассажа инкубируют при 37 С н течение

3 сут до момента формирования плотного слоя

При заражении вирусом полиомиелита, штаммом Сэбина, типом I среду из культуральных сосудов сливают, клетки один раз промывают рабочим раствором Эрла и вводят вируссодержащую среду из расчета не более 1 БОЕ на клетку. В качестве поддерживающей среды используют 0,3%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Эрла, ph

7,5. Культуры инкубируют при 34 С.

Сбор вируса проводят на 3-4 сут, Вируссодержащую жидкость хранят при о

-20, Титр вируса определяют по методу образования бляшек при заражении первичной культуры клеток почек африканских зеленых мартьппек. Титр вируса равен 7,71 1g БОЕ/мл.

1317021

Формула изобретения

Составитель М,Серова

Редактор И.Сегляник Техред М.Ходанич Корректор С,Шекмар

Заказ 2394/23 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 2, Клетки штамма

M-22 на уровне 20 пассажа получают и заражают вирусом полиомиелита „ штаммом Сэбина, типом ХХ по способу, описанному в примере .1. При этом титр вируса составляет 7,75 Ig БОБ/мл.

Пример 3. Клетки штамма М-22 на уровне 20 пассажа пол †-<ают и заражают вирусом полиомиелита, штаммом

Сэбина, типом III по способу, описанному в примере 1. При этом титр

-вируса равен 7,65 Ig БОЕ/мл.

Пример 4, Клетки штамма М-22 на уровне 25 пассажа получают, как указано в примере 1, только используют клетки 24 пассажа и заражают вирусом ECHO-11 из расчета 1 БОБ на о клетку. Культуры инкубируют при 37 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют

7,5 его титр который равен 10 ТЦД

Пр е р М-22 на уровне 25 пассажа получают, как указано в примере 4, и заражают рино вирусом из расчета 2-3 БОЕ на 1 клетку, Культуры инкубируют при 37 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют его титр, который равен 7х10 ТЦД

Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека Р 2-3-2 (Коллекция клеточных культур Института вирусологии им. Д,И.Ивановского), используемый для культивирования вирусов,