Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах

 

Изобретение относится к аналитической химии, а более конкретно к способам количественного определения азота (А) и сырого протеина (СП) в биологических материалах, например в кормовых дрожжах. Целью из,обретения является экспрессное определение азота и сьфого протеина. Способ включает следующие операции: минерализацию образца концентрированной серной кислотой, окисление аммиака до А гипобромитом и фотометрическое определение концентрации А, Добавление в пробу биологического материала буферного раствора в виде 18-22 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натра обеспечивает экспрессное определение А и СП. 2 табл. с W QO к ел со О5 tc

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А 1 (19) (И) (51) 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ф Р-/

Хр а

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ С8ИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3927913/? 8-13 (22) 09.07.85 (46) 23.07;87. Бюл, № 27 (71) Научно-производственное гидролизное объединение Гидролизпром" (72) Г.А.Соболева и Е.А.Попова (53) 547.96(088.8) (56) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье.. Методы определения азота и сырого протеина. ГОСТ 13496.4-84.

Плешков Б.П, Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1976. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО. ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЗОТА И СЫРОГО ПРОТЕИНА ф БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ (57) Изобретение относится к аналитической химии, а более конкретно к способам количественного определения азота (А) и сырого протеина (СП) в биологических материалах, например в кормовых дрожжах. Целью изобретения является экспрессное определение азота и сырого протеина. Способ включает следующие операции: минерализацию образца концентрированной серной кислотой, окисление аммиака до A гипобромитом и фотометрическое определение концентрации А. Добавление в пробу биологического материала буферного раствора в виде 18-22 см

107-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натра обеспечивает экспрессное определение А и СП.

2 табл.

13253

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах, например в кормовых драж5 жах.

Цель изобретения — экспрессное определение азота и сырого протеина.

Способ количественного фотомет10 рического определения азота и сырого протеина. в биологических материалах осуществляется следующим образом.

В колбу Кьельдаля вместимостью

250 см вносят 0,4-0,5 r (точная навеска) измельченного биологического материала с содержанием азота 1060 мг, добавляют 8-10 см 30 -ного раствора перекиси водорода, перемешивают, добавляют 13-14 см концентрированной серной кислоты, содержащей селен, и вновь хорошо перемешивают.

Колбу помещают на электроплитку и проводят озоление до полного обесцвечивания раствора. Время озоления сос- 2 тавляет 1,5-2 ч. После осветления раствор охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью

200 см . Раствор доводят до 200 см дистиллированной водой и перемешивают.

Для определения азота предлагаемым фотометрическим способом в мерную колбу вместимостью 100 см вносят

5 см минерализата с содержанием кон35 центрированной серной кислоты 0,250,35 см> и добавляют 18-22 см 10 ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М. растворе едкого натра. Пробы хорошо перемешивают 4 з и добавляют 15 см гипобромита, приготовленного при смешивании двух частей 0,07 М раствора гипохлорита и одной части 2Х-ного раствора бромистого калия в 10 -ном, растворе двузамещен- 45 ного фосфорно-кислого калия, Содержимое колбы вновь хорошо перемешивают и оставляют стоять 3 мин, затем объем доводят до 100 см дистиллированной водой и вновь перемешивают.

Точно так же подготавливают холостую пробу на реактивы, где вместо

5 см1 минерализата биологического материала вносят 5 см раствора, содержащего, как и в испытуемой пробе, 0,25-0,35 см концентрированной серной кислоты, Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при 330 нм в кюветах с толщиной

62 2 слоя 10 мм или на фотоэлектроколори- метре типа КФК-2 при 365 нм в кюветах с толщиной слоя 30 мм.

О содержании азота судят косвенно по избытку гипобромита, не вступившего в реакцию окисления аммиака до азота. При измерении оптической плотности растворов из-за меньшей окраски, которую имеет испытуемая проба, ее используют в качестве контроля, измеряя относительно нее оптическую плотность холостой пробы.

Содержание азота находят по калибровочной кривой, которую строят в. пределах от 250 до 1500 мкг, используя в качестве стандартного раствора аммоний хлористый в концентрации

1,91 г/дм .

Пересчет на сырой протеин прово-. дят путем умножения количества определенного азота на коэффициет 6,25.

С целью уточнения концентрации раствора трехзамещенного фосфорнокислого калия в смеси с едким натром, обеспечивающим рН, оптимальный для . проведения реакции с гипобромитом, проведен ряд экспериментов.

В качестве биологического материала используют товарные кормовые дрожжи рода Candida, выпускаемые гидроI лиэными заводами микробиологической промьшшенности, и низший плесневой гриб Paecilomyces carneus, выращенный йа гидролизате древесины. Определение сырого протеина проводят фотометрическим и титриметрическим способом. Титриметрический способ взят для сравнения, как наиболее достоверный и хорошо воспроизводимый.

В качестве биологического материала взяты дрожжи, содержащие 50,5Х сырого протеина (определяют титриметрическим способом).

Пример 1. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки 16 см 1ОХ-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра, перемешивают и добавляют 15 см гипобромита. Пробу вновь хорошо перемешивают и отстаивают 3 мин, затем объем доводят до 100 см дистиллированной водой, вновь хорошо перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора на. фотоэлектроколориметре типа КФК-2 в кюветах с толщиной слоя

30 мм при длине волны 365 нм. Время

Э 13253 анализа 10 мин. Во всех последующих примерах время анализа остается практически постоянным. Определено сырого протеина 48,l . Результат определе5 ния занижен IIO сравнению с титриметрическим способом, принятым за эталон, на 4,8 отн. . Такая точность определения азота неприемлема и получена из-за недостаточного количества буферного раствора, взятого меньше минимального количества, Пример 2. Б мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки при помешивании !8 см !О ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сырого протеина 50,3, 20

Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом составляет 0,4, что являетсявполне приемлемым и соответствует минимальному использованию буферного раствора. 25

Пример 3. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минералиэата, добавляют из бюретки 20 см 10 -ного раствора

3 трехэамещенного фосАорно-кислого ка- Эц лия в 0,45 M растворе едкого натра и далее по примеру l.

Определено сырого протеина 50,7 .

Относительное отклонение по срав-f нению с титриметрическим способом сос35 тавляет 0,4, Данное количество буАерного раствора является оптимальным.

Пример 4. В мерную колбу" вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки 22 см 10Х-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в

0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1. 45

Определено сырого протеина 51,1 .

Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом составляет 1,2 . Точность определения вполне приемлема и соответствует максимальному количеству расходования буАерного раствора.

Пример 5. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 24 см 10Хного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 M растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сырого протеина 51,8Х.

62

Относительное отклонение составляет 2,5Х. Дальнейшее увеличение количества добавляемого буферного раствора снижает точность измерения и выходит эа рамки выбранного диапазона, Пример 6. В мерную колб1 вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 20 см-

10 -ного раствора трехэамещенного фосфорно-кислого калия в 0,35 М раст-, воре едкого натра и далее, по примеру 1.

Определено сырого протеина 48,9 .

Относительное отклонение от титриметрйческого способа определения составляет 3,2Х Изменение молярности за рамки диапазона снижает точность измерения.

Пример 7. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кис3 лого минерализата и добавляют 20 см

10 -ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40 M растворе едкого натра и далее по -примеру 1.

Определено сырого протеина 50,9, Относительное отклонение от титриметрического определения составляет

0 8Х. Точность приемлема и соответствует минимуму необходимой молярности.

H p и м е р 8, В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см минералиэата и добавляют 20 см 10 .-но3 го раствора трехзамещенного фосфорнокислого калия в 0,48 M растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сырого протеина 50,2 .

Относительное отклонение от титриметрического определения составляет

0,6Х. Точность приемлема и соответствует максимуму необходимоймолярности.

Пример 9. Б мерную колбу з вместимостью 100 см вносят.5 см минерализата и добавляют 10 см 10 3 ного раствора трехэамещенного АосАорно-кислого калия в 0,50 M растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сырого протеина 49,9 .

Относительное отклонение от титриметрического определения составляет

1,2Х. Точность определения значительно снижается, так как молярность выше максимума.

В табл, 1 представлено определение сырого протеина в кормовых дрожжах рода Candida и в биомассе гриба

Paecilomyces carneus в зависимости

132

20 от количества и концентрации предлагаемого буферного раствора.

Из данных табл. следует, что результаты определения азота и сырого протеина, полученные при добавлении 10 -ного раствора трехэамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра в количестве 1822 см, хорошо сопоставимы с титрии метрическим способом. В этих случаях относительное отклонение от титриметрического способа не превьппает 2,5 .

Оптимальной добавкой является 20 см

lOX-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра. Добавление такой концентрации при всех определениях имеют. наименьшее относительное отклонение от титриметрического способа, которое не првьппает 0,8 ..

Добавка свьппе 22 см буферного раствора приводит к небольшому, но систематическому завьппению результатов определения количества сырого протеина, а при добавлении буферного раствора меньше 18 смз получают данные, отличающиеся от данньгх, полученных титриметрическим способом,,почти на 6Х.

Добавление к минерализату 20 см

10Х-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 M раствора едкого натра обеспечивает достаточно высокую эффективность использования предлагаемого способа, Введение в пробы для анализа 20 см

lOX-ного трехзамещенного фосфорнокислого калия в 0,40 М и 0,48 М растворах едкого натра также дает результаты практически одинаковые с результатами титриметрического анализа.

При использовании буферного раствора на 0,50 И едком катре в случае определения сырого, протеина в низшем грибе получен результат выше титриметрического на 4,6 отн.Х, что неприемлемо, В табл. 2 приведены сравнительные результаты по определению сьгрого про5362 6 еина в дрожжах пробы 1, полученные известным и предлагаемым способами.

Для анализа один и тот же образец дрожжей подвергают минерализации в пяти повторностях. Затем в каждом полученном минерализате проводят три параллельных определения содержания сырого протеина различными способами: титриметрическим, фотометрическим !

О по ГОСТУ, косвенным фотометричекким по реакции с гинобромитом после предварительной нейтрализации минерализата 1 М раствором едкого натра и предлагаемым косвенным фотометрическим !

5 методом по реакции с гипобромитом после добавления 20 см буферного растз нора 1 OX-ного трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 И растворе едкого натра.

Проведенная статистическая обработка этих даннъгх показывает, что наименьшее отклонение результата прн доверительном уровне 0,95 имеет титриметрический способ определения сырого протеина. При использовании известного фотометрического способа определения (согласно ГОСТУ) находят сырого протеина меньше,.в среднем на 1 5 отн. .

З0 и при большем отклонении результата, чем при определении сырого протеина титриметрическим способом, Формула изобретения

Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах„ включающий минерализацию образца концентрированной серной кислотой, окисление аммиака до азота гипобромитом и фотометричес-, кое определение азота, о т л и ч а юшийся тем, что„ с целью экспрессности анализа, после минералиэации в

45 пробу добавляют буферный раствор, состоящий из 18-22 см 10Х-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натрия.

1325362!

1 I Ф х о

I О Х о л

1- Ф о 11

CO

О о

° В! о ! о

Ю

Ф х х

Q) х фl

1 м

an х!

К(I ) Ф х о

v x о à

I Х

t Ф

О 1I-1

1 )Ч

I в

)о! х

3 ф(Х

-! й! * о

Ю Ю

l о ! о

ЬЬ

Ф х х

Ф х

ВЬ

С 1

О Ъ

Ц к о

Ю

I с (х о о х о м

1

О х х к.х (ФВ( о с со

СЧ

О1 л

° В

Ь

СО

ЬЬ

CO (С 3 ( ( — —  — — -В1 1 Ф х о

v x о ((1

an 3» C) о (в

I о (!

» о ьо

Ю и

X о

1» о

ЬЬ

1

1

1 .l

I !

1

1

1 а г ——

1 34

 — + ——

1 3 Ф

СЧ

Ю! о

2 о х о

v x о л

I Х

I 3 Ф о t»

1 3 I ——

1 СЧ

1 1

Г Т

1 I I о

Х 1 (СЧ«-х

O х î

Ф х

ЬЛ

СЧ м

Ю м

ВЬ

СЧ оь ь

СС

СУ Ь

СЧ о

I

I

Ф х

Х)Ч

Ф I х

-- - ---3 (1

СЧ

° В

СЧ

ВЬ ь

С(ВЬ о (Ф )4 о !»

1 w О О 3- Х О

2 3

cfl 1

ы г —,-"т ——

1 A 1 е

О 1 о Ф

1 I o p4 к

О Х t Ф )С Х ж х (» Ф о х

СЧ

° n ьо

Ф

I

an

СЧ

° В

t- x o о ох г — -т= "—

СЧ

ЬЬ

С Ъ

ВЬ

СЧ

I о

Х 1 х

Ф о Ф х

& ФЖ о о

1 Ф

1 aa: !

1 (()

lO!

t

1 (CO

l ) ЬС

ВЬ

CO о

С

1 ф

1 Р(1. 3» о

1 Ф

1! 2

l !

I !

t ьР

I

I !

ХО( (.ОХОФ

1 о

ВЬ

СЧ

ЬЬ ю

3

3 ! В

I х

Р, ххо ьо

СЧ

С) ° В1

00

СС

ВО

an

С3 о х

О

v ao

ai

ОО3ц х Ф ф

Ф Ю У Е

Я 1в о

I o ! Ф

1 Х

1 Х

i (: о

В

ЬЬ

1

1

1

1

1

1

I

I X

° В

I Х (" о о х

РВ

I

1

l

l

1 !

ЬЬ

3 Ж

1 О ф

1 Я

1 K

1 м1

1 ! О

1 д о о

РВ

v х х

K а

С .( о

1

I

1

1 О

ВСЪ

ЬЬ

1 О

1

I

1

t ! CO

1 Ф

° ь

1 О

1

34 1

I — —

1 (1

1

1 (о 1

1

1 (1

1

1

1

М !

ВЬ

О) ° Ь

СЧ

° Ь

СЧ

ЬО

ЬЬ о

СЧ

° Ь м

СЧ

С»

»Ь

В/Ъ

ce I .

v o o

Ц С. е Р фффЛаФ

X1IavвС

oc) ХФ Vt

ХХ Рфуф щхс,() йv

1325362

Т а б л и ц а 2

Минералиэат

Содержание сырого протеина, 7., полученного методом фотометрическнм фотометрическим со титриметркческим

Предлагаемый с гласно

ГОСТУ

52,4

52,9

53,2

51,9

53,7

52,7

52,1

49,6

52,8

53,6

52 7

52,6

52,8

50,0

52,2

52,3

52,9

52,6

52,0

52,6

52,6

52,9

52,3

51э6

50,4

52,0

51,0

51,6

50,5

52 0

52,7 52, 1

51,2

51,9

53,5

51,4

51,6

52,4

52,3

52,3

53,2

53 1

50,5

53 2

51,4

53,1

52,4

52,7

52,9

52,6

50,7

52,7

61,6

53 2

52,3

53,4

52,7

52,6

53,2

Характеристика х й$й 52,4 0,14 51,6+0,68 57,3+0,37 52,6+0,52 !

Составитель И.Тареева

Техред В.Кадар Корректор В.Бутяга

Редактор А.Козориз

Заказ 3101/39

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Известный с нейтрализацией применением буферного раствора