Способ получения реактива для количественного определения глюкозы

 

Изобретение относится к аналитической биохимии, а именно к способам измерения, использующим ферменты, и может быть использовано для определения содержания глюкозы в автоанализаторах, применяемых в микробиологической пррмьшшенности и медицинской практике. Цель изобретения - повышение точности количественного определения глюкозы в растворах. Способ осуществляют путем введения в отдельно приготовленные растворы глюкозооксидазы и каталазы в ацетатном буфере порознь окислителя - периодной кислоты или ее натриевой или калиевой соли в массовых соотношениях ферментокислитель 1:0,1-0,7. Образовавшиеся низкомолекулярные примеси отделяют диализом и полученные растворы в соотношении 1:1 по активности смешивают с этанолом. 2 табл. а S сл :о ее

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (5)) У С 12 Q !/26, l/30

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4037230/31-13 (22) 17 ° 03.86 (46) 30.08.87. Бюл. № 32 (71) Институт биохимии им. А.В, Палпадина и Научно-производственное объединение "Промавтоматика" (72) M Ô. Гулый, А.В. Гудкова, Н.В. Латышко, P.Ã. Дегтярь, А.Н. Халюткин, В.В. Бирюков и С.Б. Ицыгин (53) 577.15(088.8) (56) Lim Н.Н. An evaluation of the

Beckman Glucos Analisen-2, I. Malay"

sio vol ° XXXIII, № 4, Iune, 1979 °

Заявка Франции № 2558849, В С 12 Q 1/26, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАКТИВА ДЛЯ

КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ (57) Изобретение относится к аналитической биохимии, а именно к способам измерения, использующим ферменты, и может быть использовано для определения содержания глюкозы в автоанализаторах, применяемых в микробиологической промышленности и медицинской практике. Цель изобретения - повышение точности количественного определения глюкозы в растворах. Способ осуществляют путем введения в отдельно приготовленные растворы глюкозоок-сидазы и каталазы в ацетатном буфере порознь окислителя — периодной кислоты или ее натриевой или калиевой соли в массовых соотношениях ферментокислитель 1:0,1-0,7. Образовавшиеся низкомолекулярные примеси отделяют диализом и полученные растворы в соотношении I:1 по активности смешивают с этанолом. 2 табл.

1 13337

Изобретение относится к аналитической биохимии, а именно к способам измерения, использующим ферменты, и может быть использовано для опреде"

5 ления содержания глюкозы в автоанализаторау„применяемых в микробиологической промышленности имедицинской практике, Цель изобретения — повышение точности определения глюкозы. 10

Способ осуществляется путем введения в отдельно приготовленные растворы глюкозооксидазы и каталазы в ацетатном буфере порознь окислителя— периодной кислоты или ее солей )5 в массовом соотношении фермент — окислитель 1:(0,1-0,7), затем низкомолекулярные примеси отделяют и растворы .каталазы и глюкозооксидазы в соотно шении 1:1 по активности смешивают с 20 этанолом.

Согласно предлагаемому способу в реактив вводят отдельно приготовленные растворы окисленной глюкозооксидазы и катализы в эквивалентных по 25 активности количествах в отличие от известных способов, где каталаза в реактиве отсутствует или содержится только в виде примесей. При предварительной обработке каталазы и глюкозооксидазы периоднойкислотой илиее солями окисляется углеводный компонент ферментов, что стабилизирует сам фермент. При этом ферментный реактив очищен от низкомолекулярных примесей,. которые проникают через мембрану в анализируемую среду.

Эти условия получения реактива обеспечивают продолжительность эксплуатации его без снижения точности 40 измерений содержания глюкозы при непрерывной продолжительной работе автоанализатора. Способ иллюстрируется примерамн конкретного получения реактива и.испытания его в условиях непрерывного автоматического режима.

Подбор условий стабилизации ферментов глюкозооксидазы и каталазы представлен в табл. 1, где в примерах 6-9 пред.ставлены запредельные значения соотношений фермент-окислитель.

Пример 1. 400 мг глюкозооксидазы, соответствующих 100000 единиц активности, растворяют в 40 мл >

0,05 M ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 18,4 мл 0,57.-ного

KJO (92 мг) (соотношение 1:0,25), смесь перемешивают и инкубируют 3 ч

О при 4-8 С. Затем прибавляют 0,042 мл.

12 2 этиленгликоля, 30 мин перемешивают и ( ( диализируют для удаления нйзкомолекулярных примесеи. 40 мг к талазы, ! соответствующих 100000 еди иц активности, растворяют в 4 мл 0 05 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, доВявляют I,84 мл O,Б ;вага )JO< (9,2мг) приэтом соотношени фермент— окислитель равно 1:0,28, сме ь перемешивают и инкубируют 3 ч при >-8 С. Затем прибавляют 0,004 мл этиленглико. — .

| ля, 30 мин перемешивают и диализируют для удаления низкомолекулярных примесей. Растворы глюкозооксид зы и каталазы в соотношении по акти ности 1:1 смешивают с этанолом до конечной кон( центрации этанола 257.

Пример 2. 400 мг глюкозооксидазы, соответствующих 10i000 единиц активности, растворяют в 5i мл 0,05М ацетатном буферном раствор рН 5,8, добавляют 8 мл 0,57-ной HJ 4 2Н20 (40 мг) (соотношение ферме .т — окис-., литель 1:0 1) и далее операции повто1 ! ряют по аналогии с примером 1,40 мг каталазы,. соответствующих 100000 единиц активности, раствор .ют в 5 мл

0,05 M ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 0,8 мл Оl57-ного

HJ0q 2HzO (4 мг). Послед пцие операции повторяют по аналогии с приме( ром 1. (Пример 3. 400 мг глюкозооксидазы, соответствующих 10ф000 единиц активности, растворяют в 30 мл (0,05 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 28 мл 17- ного

NaJO4 3HzO (280 мг), приlэтом соот( ношение фермент-окислитель равно !

1:0,7 и далее операции повторяют по аналогии с примером 1.

40 мг каталазы, соответствующих

100000 единиц активности, растворяют в 3 мл 0,05 .М ацетатном буферном растворе .рН 5,8, добавляют 2i8 мл

17-ного NaJ04 3HzO (28 мг). Последующие операции повторяют по аналогии с примером 1. (При соотношении фермент 1 к окислителю 1:(0,1-0,7) окисляетс1 около

307. углеводов фермента при, сохранении 1007-ной активности, У еньшение соотношения фермент — окислитель ме1 нее 1:О,1 (примеры 6 и 7) яе обеспечивает достаточного окисления углево1 дов и, следовательно,4необкодимой стабильности. С увеличением количест(Таблица 1

Каталаэ а

Пример .

Глюкозооксидаэа

Соотношение каталазаглюОкислеАктивность, Ак гивОкисленость ние уг" леводов, Ж ние углеводов, Ж козооксидаза к окисли телю

100,0 !

00,0

100,0

100,0 2

100,0 2

100,0 30

100 0 35

100,0 41

1:0,025 0

1:0,05 5

1:0,1 27

1:0,2 31

100,0

1:0,25 33

100,0

3 13337 ва окислителя более 1:0,7 (пример 8 и 9) процент окисленных углеводов растет,.но при этом уменьшается активность фермента. Экспериментально

5 доказано, что дальнейшее увеличение концентрации окислителя не способствует интенсификацииокисления углеводов при одновременной потере каталитической активности фермента.

1О

Сравнительные испытания ферментных реактивов, приготовленных по предлагаемому и способу-прототипу, принятому в качестве базового и применяемого на анализаторе "Glucose

Analizer-2" фирмы "Бекман", проводили в автоанализаторе АКГ-01 при измерении концентрации глюкозы в модельном растворе глюкозы 1 г/л с периодичностью 36 "мин в течение 20 сут.

Испытания показали, что благодаря использованию предлагаемого реактива значительно увеличивается время непрерывной работы без снижения точности .показаний (табл.2). 25

Измерения содержания глюкозы на

6-й день и далее по базовому реактиву в связи со значительными погрешностями не проводили.

Как видно иэ результатов испытаний, З0 на 2-е сут точность измерений у базового объекта падает íà 24Х, а у предлагаемого сохраняется еще на 17 сут (допустимые потери + 5X).

Использование реактива, полученного согласно предлагаемому способу, 1г

4 обеспечивает значительное повышение точности измерения содержания глюкозы при непрерывйом проведении анализов благодаря стабилизации реактива, а также возможность использования автоанализаторов глюкозы для контроля в процессах ферментации, продолжительность которых исчисляется несколькими сутками с соблюдением условий герметизации.

Реактив, полученный согласно изобретению, может быть использован в процессе биосинтеэа антибиотиков.

Формула изобретения

Способ получения реактива для количественного определения глюкозы в растворе, предусматривающий приготовление ферментного раствора глюкоэооксидаэы и каталаэы в ацетатном буфере в заданном соотношении и смешивание с одноатомным спиртом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности непрерывного определения глюкозы, одновременно готовят растворы глюкозооксидаэы и каталазы в ацетатном буфере, вводят в них периодную кислоту или ее калиевую и натриевую соли в массовых соотношениях фермент — окислитель 1:(0,1-0,7), низкомолекулярные примеси отделяют диализом и полученные растворы, взятые в соотношении !:I по активности смешивают с этанолом.

1333712

Продолжение табл.I

Каталаза

Глюкозооксидаза

Пример

Активность, Х

ОкислеОкислеАктивость, ние углеводов, 1 ние углеводов, даза к

Окислителю

i:0,4 30

1:0,7 36

1:1,0 43

1:1,5 51

100,0 (100, 0

95,0

93,1 (1 (Продолжение табл.2! —.бТаблица 2

25 !

Измерение содержания глюкозы, X

Измерение содержания глюкозы, Ж

Базовый реак- Пре агаемые тив (прототип) реактив

Базовый реак- Предлагаемые тив (прототип) реактив

100,0+ 0,32

100,0+ 0,58

100,0 + 0,72

100,0 2 0,83

100,0 « 1,48

10 з5 12

17

95 ° 7 1 3 ° 47

83,2 - 2,88

20

Составитель Л, Борисова (Техред N.Õîäàíè÷ Корректор С, ШекмарРедактор М. Недолуженко ( (Подписное

Заказ 3926/24 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

1 .Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

100, 0

76,4 0,6

77,8 1,3

66,6 1 1,75

Соотношение катапазаглю козоокси100,0 42

100,0 44

94,3 50

94,1 57

100, + 0,85

100, + 2,24 (98,3, 0,53 ( (97,1 1- 0,08 (