Способ определения дегидрогеназ листьев чайного растения

 

Изобретение относится к биохимии , а именно к способам изучения ферментов и идентификации дегидрогеназ листьев чайного растения. Цель изобретения - повышение информативности способа путем одновременного определения шести дегидрогеназ. Для этого частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растения наносят на полиакриламидный гель, проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют в буферных растворах с рН 7,1+0,1 - 8,65+ +0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстрактами, катализаторами и пиридиновыми нуклеотидами при 20-55°С, В качестве красителей используют нитросиний тетразолий (ИСТ) в присутствии феназинметасульфата (ФМС). Раствор ИСТ готовят, растворяя в 1 мл воды 20 мг нет, раствор ФМС - в 1 мл воды 3 мг ФМС. Окра- ,. шивание ведут при 30-35 С 3-7 ч, после чего окрашенные гели фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте. (Л со о 00 со о:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК р ргc р Р !

13 ..

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И QTHPblTHA (21) 3804281/28-14 (22) 22. 10.84 (46) 15.04.87. Бюл. 1Ф 14 (71) Всесоюзное научно-производственное объединение по чаю и субтропическим культурам (72) И.Л. Берулава (53) 616.07(088.8) (56) Моргиладзе 3.Н. Сообщения

АН ГССР. 1972, т. 66, У 1, с. 30. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗ

ЛИСТЬЕВ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способам изученияферментов и идентификации дегидрогеназ листьев чайного растения. Цель изобретения — повышение информативности способа путем одновременного опреде, SU„„1303937 A1 д11 4 G 01 N 33/48, С 12 Q 1/26 ления шести дегидрогеназ. Для этого частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растения наносят на полиакриламидный гель, проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют в буферных растворах с рН 7,1+0,1 — 8,65+

+0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстрактами, катализаторами и пиридиновыми нуклеотидами при 30-55 С. В качестве красителей используют нитросиний тетразолий (НСТ) в присутствии феназинметасульфата (ФМС). Раствор НСТ готовят, растворяя в 1 мл воды 20 мг НСТ, раствор ФМС вЂ” в 1 мл воды 3 мг ФМС. Окрао шивание ведут при 30-35 С 3-7 ч, пос- ® ле чего окрашенные гели фиксируют в

10%-ной уксусной кислоте.

1303937

30

2,0

0,7

0,7

1

0,2

1,5

0,7

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам изучения изоферментов, в частности к способам идентификации дегидрогеназ листьев чайного растения. 5

Цель изобретения — повышение информативности способа за счет одновременного определения шести дегидрогеназ.

Способ осуществляют следующим образом.

Частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растения наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют в буферных растворах с рН 7,1+0,1

8,65+0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстратами, катализаторами и пиридиновыми нуклеотидами при 30-55 С. В качестве красителей используют нитросиний тетразолий (НСТ) в присутствии феназинметальсуфата (ФМС).

Раствор НСТ готовится растворением

25 в 1 мл воды 20 мг НСТ, раствор ФМС в 1 мл воды 3 мг ФМС. Окрашивание происходит при 30-35 С в течение 3

7 ч, после чего окрашенные гели фиксируются в 10Х-ной уксусной кислоте.

Пример 1. Определение изоцитратдегидрогеназы. Одним из известных способов получают суммарный препарат белков и ферментов на геле и для избирательного окрашивания изоцитратде- 35 гидрогеназы препарат помещают в кювету с раствором. содержащим:

Трис-НС1 буфер 0,05 М рН 8,5, мл 50

Изоцитрат натрия, мг 75 40

MgC1 (10X-ный водный раствор), мл 0,2

НАДФ, мг 10

НСТ (20 мг на 1 мл роды), мл ФМС (3 мг на 1 мл воды.), мл 0,7

J о и выщерживают в термостате при 35 С в течение 3 ч. Окрашенный препарат фиксируют в 107. †н уксусной кислоте.

2

Трис-НС1 буфер О, 1 M рН 7,1, мл

Гипоксантин 1 М, мл

НАД, мг

HCT (20 мг на 1 мл воды), мл

ФМС (3 мг на 1 мл воды), мл выдерживают при 35 С в течение 7 ч, после чего фиксируют в 10Х-ной уксусной кислоте.

Пример 3. Определение альфаглицерофосфатдегидрогеназы, Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим:

Транс-HCl буфер 0,1 М рН 8,0, мл 50

Альфа-глицерофосфат натрия, мг

НАД, мг

НСТ (20 мг на 1 мл воды), мл 1,5

ФМС (3 мг на 1 мл воды), мл выдерживают при 35 С в течение 7 ч, после чего фиксируют в 10Х-ной уксусной кислоте.

Пример 4. Определение лактатдегидрогеназы. Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим:

Фосфатный буфер О, 1 М рН 7,4, мл

Лактат натрия I M, мл

NaC1 (10Х-ный раствор), г

MgC1 (10K-ный раствор), мл

НАД, мг

НСТ (20 мг на 1 мл воды), мл

ФМС (3 мг на 1 мл воды),мл выдерживают при 30 С в течение 7 ч.

После чего фиксируют в 107. †н уксусной кислоте.

Пример 5 ° Определение сорбитолдегидрогеназы. Суммарный препарат белков и ферментов на, еле помещают в кювету с раствором, содержащим:

100

2,0

Пример 2.Определение ксантиндегидрогеназы. Одним из известных способов получают суммарный препарат белков и ферментов на геле и для из55 бирательного окрашивания ксантиндегидрогеназы препарат помещают в следующую среду:

Транс-НС1 буфер О, 1 М рН 8,65, мл

Сорбитол, мг

НАД, мг

НСТ (20 мг на 1 мл воды), мл

1303937

Составитель Н. Гуляева

Техред И.Попович Корректор Л.Патай

Редактор А. Ревин

Заказ 1303/45 Тираж 777 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5!

1роиэводственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

ФИС (3 мг на 1 мл воды), мл 0,7 о выдерживают при 35 С в течение 7 ч и фиксируют в 107-ной уксусной кислоте.

Пример 6. Определение окта- 5 нолдегидрогенаэы. Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим:

Транс-НС1 буфер 0,1 M рН 8,5, мл 50 10

Октанол, мл 2

НАД, мг 25

НСТ (20 мг на 1 мл воды), мл 2,0

ФМС (3 мг на 1 мл, воды), мл 0,7 выдерживают 7 ч при 35 С и фиксируют в 107-ной уксусной кислоте.

Формула и з обре т е н и я

Способ определения дегидрогеназ листьев чайного растения путем получения частично очищенного препарата ферментов, нанесения его на полиакриламидный гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, субстрат, нитросиний тетраэолий и феназинметасульфат и идентификацией ферментов по окрашенным полосам на геле, отличающийся тем, что, с целью повышения информативнос- . ти способа эа счет одновременного определения шести дегидрогеназ, при инкубации используют буферные растворы с рН 8,5+0,1, 7,1+О, 1; 8,0+0,1, 7,4+О, 1; 8,65+0, 1 и 8,5+0, 1 для определения изоцитратдегидрогеназы, коантиндегидрогенаэы, . -глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сорбитолдегидрогеиазы и октаиолдегидрогеназы соответствен-. но °