Штамм @ @ ,используемый для тестирования мутагенных агентов

 

Штамм Salmonella typhiraurium № 59 (Музей микроорганизмов Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи , используемый для тестирования мутагенных агентов. (Я с

СООЭ СОВЕТСНИХ

OH

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3867053/28-14 (22) 15. 03. 85 (46) 07. 10,86. Бюл. У 37 (71) Научно-исследовательский ордена

Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи (72) А.-В ° Г.Скавронская, И.В,Андреева, И.И.Лямкина, Н.Ф.Степанова н Г.Ф.Абдухалыкова (53) 576.8.093(088.8) (56) Ames В. et al, in I. proceeding

Natl. Acad. Science, USA, 1973, ч.7, р. 782.

Maron D. -and Ames В. in I. Mutat.

Research, 1983 v° . 113 p° . 173 °

»SU,m 1261953 А1 (м 4 С 12 Я 1/02//С 12 М 15/ОО (54) ШТАММ SALMONELLA ТТРН?МНКП%, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ МУТАГЕННЫХ АГЕНТОВ. (57) Штамм Salmonella typhimurium

В 59 (Музей микроорганизмов Научно- . исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, используемый для тестирования .мутагенных агентов.

1 . 12

Изобретение относится к области микробиологии, в частности, к генетике микроорганизмов, и может быть использовано для отбора мутагенных агентов.

Целью изобретения является создание нового штамма, позволяющего в отсутствие R-плаэмид эффективно выяв" лять мутагенные агенты, индуцирующие мутации различного рода,:возникающие в результате эамены пар оснований и/или сдвига рамки считывания.

Salmonella typhimurium штамм AG

262 (9 59) получен на основе штамма

Эймса ТА 1535, Штамм AG 262 получен в результате мобилизации с помощью плаэмиды Н1йгй

i6 фрагмента хромосомы Е.coli, содержащего umu С -ген.

В геном этого штамма в результате обработки YCR-191 введена мутация в аргининовый ген, возникшая вследствие сдвига рамки считывания. Arg-мутация картирована на 88 мин.генетической карты сальмонелл.

Штамм Salmonella typhimurium хранится в Музее микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф,Гамалеи в лиофилизированном виде под номером 59 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковиднай формы размером 2-4 х 0,5 мк, подвижные граммотрицательные.

Культуральные свойства.

Ауксотроф: зависит от гистидина и аргинина. Не утилизирует лактоэу.

На минимальной синтетической среде А с добавками гистидина и аргинина (no 30 мкг/мл) и глюкозы (0,47) через 48 ч роста при 37 С образует колонии, имеющие диаметр 1 5-2 мм с ровными краями.

На L-агаре через 24 ч роста дает мелкие блестящие колонии до 2 мм в диаметре.

В L-бульоне растет в виде равномерного помутнения.

На питательном агаре Дифко через 24 ч роста при 37 С образует очень мелкие (до 0,5 мм) колонии с гладкой поверхностью.

Генетическая характеристика.

Штамм У 59 представляет собой гибрид, образовавшийся в результате рекомбинации фрагментов хромосомы Е.со+ .Ф +

li несущих гены trp umuC gal

bio с хромосомой S.typhimurium. .Штамм АС 262 сохранил ряд существен61953 2 ных для его использования мутаций исходного штамма ТА 1535: мутацию по эксцизионной репарации - uvr В, мутацию, изменяющую проницаемость клеточ5 ной стенки, — rfa, мутацию hisG 46, возникшую в результате замены пар оснований. Новая мутация в arg — гене в штамме N - 59 является мутацией сдвига рамки считывания. Штамм AG 262 не

1O несет маркера канамицинреэистентности, свойственного плазмиде, использованной для получения гибрида. Фон спонтанных реверсий к гистидиннеэави1 симости 2-6/10, к аргининнезависи15 мости 1-3/10 .

Пример 1. Мутагенное действие 4 нитрохинолин-1-оксида 4(НХО), Бактерии испытуемых штаммов выращивают в Ь-бульоне в течение 18 ч при 37 С. Через 18 ч культуры разво дят в 1О раз свежим L-бульоном и выращивают на качалке при 37 С до логарифмической фазы роста. Затем культуры отмывают физиологическим раствором с помощью центрифугирования, ресуспендируют в фосфатном буфере (рН 7) и добавляют мутаген. После инкубации в течение 60 мин при 37 С культуры отмывают от мутагена центрифугированием, ресуспендируют в физиологическом растворе и высевают без разведения на среду, селективную для his

+ мутагенов, возникших в результате замены пар оснований. Для учета выживших соответствующие разведения культур высевают на минимальную среду, содержащую полные добавки аминокислот. Рабочий раствор 4НХО готовят в этаноле и хранят при +4 С. Учет результатов производят через 48 ч инкубации при 37 С.

Расчет частоты мутагенеза произа — Ь водят по формуле М = <,,где М вЂ” частота индуцированных мутаций; а— среднее количество мутантов на чашке при данной дозе; Ь вЂ” среднее количество мутантов на чашке в необработанной пробе; d — среднее число клеток, выживших при данной дозе мута50 гена.

Для сравнения полученных результатов во всех опытах наряду с предла.гаемым штаммом берут известные штаммы системы Эймса, 55 4НХΠ— сильнейший канцероген, требующий для проявления мутагенного действия индукции S0S-системы репарации ДНК, вызывает почти равно выраСоставитель Г.Смирнова

Редактор Н.Егорова Техред Л.Сердюкова Корректор О.Луговая

Заказ 5299/20 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4

3 126 женный мутагенез (замена пар оснований) на сконструированном штамме 59 и содержащем R-плазмиду штамме TA 100 и не вызывает мутагенез у бесплазмидного штамма ТА 1535. 5

Пример 2. Мутагенное действие этилметансульфоната (ЭМС).

Определение влияния ЭМС проводят, как описано в примере 1. ЭМС-агент; не требующий для проявления мутагенного действия индукции SOS-системы репарации ДНК, оказывает почти равно выраженный мутагенный эффект относительно всех 3 испытуемых штаммов.

П р и w е р 3. Иутагенное действие11 диаминодиоксиодигидродиазопирена (ДИАМ).

Определение влияния ДИАМ проводят, как описано в примере 1. Селективная среда для Arg -мутантов содержит 20

30 мкг/мл гистидина и 0,7 мкг/мл аргинина.

1953 4

Мутагенная активность ДИАМ-соединения, индуцирующего мутации сдвига рамки считывания, которые в подавляющем большинстве случаев не требуют активности гена umu С, равно выра4 жены для всех 3 испытуемых штаммов до дозы 10 мкг/мл. При более высоких дозах штамм 59 дает более выраженный мутагенез.

Однако выявление мутаций сдвига рамки считывания при использовании штаммов системы Эймса требует применения других, нежели в первых двух примерах, штаммов.

С аналогичными результатами были испытаны еще 5 различных агентов, относящихся к различным классам соединений: УФ-свет (как в примере 1) метилметансульфонат (ММС) и Н-метилN-нитро-N-нитрозогуанидин (НГ), как в примере 2. VCR-191, 9-аминоакридин (9АА), как в примере 3.