Состав для замораживания костного мозга

 

Изобретение относится к медицине , предназначено для консервирования , . культивирования и трансплантации биологических тканей, конкретно, консервирования костного мозга при ультранизк их температурах с целью трансплантации в клинике. Цель изобретения - повышение качесетва состава за счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток. Для этого используют раствор для эамораживания кост .кого мозга следующего состава. КЕСОШЗНАЯ ПАТЕНШ ТсАллЧЕСНАЙ } БИБЛИОТЕКА мас.Х : медицинский желатин 2,0-2,7; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,09-0,15; натрий лимонно-кислый трехзамещенный 0,9- 1,2; глицерин 6,6-7,4; диметилацетамид - 3,5-4,5; гемодез 6%-ный водный растдор поливинилпирролидона остальное. Навески ингредиентов последовательно растворяют. В 1/3 объема гемодеза растворяют навески диНатриевой соли этиле адиаминтетрауксусной кислоты и натрия лимоннокислого трехзамещенного. Затем добавляют желатин, глицерин, дкметилацетамид. Затем добавляют гемодез до нужного окончательного объема, рН раствора доводят до 7,0-7,5 с помощью Юн едкого натра. После фильтрации раствор разливают в стан«- дартные флаконы, стерилизуют. Раствор хорошо смешивается с, взвесью костно-мозговых клеток, предотвращает их конгломерацию, обеспечивает морфологическую сохранность ядросодержащих клеток при положит ьной температуре. 2 табл. о (5 VDEEV

СООЭ йжЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09> О1) (51) 5 A О1 N 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ l(21 ) 3886401/14 (22) 09.04 ° 85 (46) 07.01.92. Бил. 1Р 1 (7l) Центральный научно-исследовательский институт гематологии и пе реливания крови (72) А.Г.Федотенков, И.Д.Шишкина,, Л.А.Тимакова, Л.А.Данилова, Л.Н.Пушкарь, О.М.Ляйман и Т.В.Антонова (53) 615.013 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 1246967, кл.А 01 и 1/02, 1985. (54) СОСТАВ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ КОСТНОГО МОЗГА (57) Изобретение относится к медицине, предназначено для консервирования, культивирования и трансплантации биологических тканей, конкретно, консервирования костного мозга при ультраниэких температурах с целью трансплантации в клинике. Цель изобретения — повышение качевгва состава за счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток. Для этого используют раствор для заморавивания кост-.

:ного мозга следующего .состава, мас.Z: медицинский желатин 2,0-2,7; динатриевая соль этипендиаминтетрауксусной кислоты 0,09-0,15; натрий лимонно-кислый трехэамещенный 0,9l,2; глицерин 6,6-7,4; днметилацетамид — 3,5-4,5; гемодеэ 67.-ный водный раствор полнвиннлпирролидона остальное. Навески ингредиентов последовательно растворяют. В 1/3 объема гемодеэа растворяют навески динатриевой соли этилеидиаминтетрауксусной кислоты и натрия лимоннокислого трехзамещенного. Затем добавляют аелатнн, глицерин, днметилацетамид. Затем добавляют гемодез до нужного окончательного объема, рН раствора доводят до 7,0-7,5 с помощью 10н едкого натра. После фильтрации раствор разливают в стан дартные флаконы, стернлизуют. Раствор xopomo смешивается с взвесью костно-мозговых клеток, предотвра щает их конгломерацию, обеспечивает морфологическую сохранность ядросодерзащих клеток при положительной температуре. 2 табл.

1349021

Изобретение относится к медицине, к проблеме консервирования, культивирования и трансплантации биологических тканей, в частности к консервированию костного мозга при ультраниэких температурах с целью трансплантации н клинике.

Целью изобретения является повышение качества состава за счет увеличения жизнеспособности стноловых

20 клеток.

Состав раствора для замораживания костного мозга содержит,мас.Х!

Желатин медицинский 2,0-2,7 15

Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,09-0,15

Натрий лимонно-кислый

4 трехзамещенный 0,9-1,2

Глицерин 6,6-7,4

Диметилацетамид 3,5-4,5

Гемодез (6X-ный водный раствор поливинил; пирролидона) Остальное 2S

Способ приготовления раствора.

Взвешивают необходимые навески ингредиентов и растворяют их в такой последовательности. В 1/3 всего объема гемодеза растворяют навески ЗО динатриеной соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и натрия лимонно-кислого трехзамещенного. Затем добавляют необходимые объемы желатина, глицерина и диметилацетамида, после чего добавляют гемодеэ цо нужного окончательного объема. Определяют рН раствора Й доводят его до 7,0"

7,5 с помощью 1О н едкого натра.

Раствор фильтруют и разливают в 4п сТандартные бутылки вместимостью

250 мл и 500 мл по ГОСТ 10782-77.

Бутылки укупоринают пробкой из реэиноной смеси марки 25-П по ТУ

38-006269-80 и эавальцовывают алю- 4Б миниевыми колпачками по OCT 64-785-79. Затем бутылки завязывают в двойные бязевые мешки. Стерилиэуют в автоклане пфи 1,2 атм (122,7 С) н течение 30 лен 100 мл раствора 5О и 45 мин 250 мл раствора. После стерилизации раствор можно хранить при комнатной температуре или н хоа лодильнике при 4-10 С.

Готовый Раствор для замораживания костного мозга представляет собой прозрачную жидкость желтого цнеTB co tлабым специфическим запахом поливинилпирр лидоиа.

Раствор xopomo смешивается с нэнесью костномоэгоных клеток, предотвращает нх конгломерацию, обеспе- чинает морфологическую сохранность ядросодержащих клеток при положительной температуре.

Пример 1. Вэнешивают 0,09 r динатриеной соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,9 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного. В 300 мл гемодеэа растворяют эти навески. Затем добавляют 2,00 мл 10Х-ного раствора желатина медицинского в ампулах . для инъекций (2,0 мас.X) 66 мл глицерина и 35 мл диметилацетамида, после чего добавляют гемодеэ до конечного объема l л. Определяют рН раствора 6,6 и доводят его до 7,2 с помощью 10 н растора едкого натра.

Раствор фильтруют и разливают в стандартные бутылки вместимостью

250 ип. Бутылки укупоринают резиновыми пробками, эавальцовынают алюминиевыми колпачками, завязывают в двойные бязевые мешки. Раствор стерилизуют н автоклаве при 1,2 атм (122,7 С) в течение 45 мин.

5 мышей линии (СВАхС57В16)Р, весом 18-20 r умерщвляют, извлекают бедренные кости с помощью шприца, вылынают костный моэг. раствором.

Взвесь ресуспендируют путем многократного пропускания через ииъекционную иглу, затем фильтруют в стерильный флакон. Объем взвеси костномоэговых клеток в растворе составляет 60 мл. Берут пробу на подсчет для определения количества ядросодержащих клеток н жизнеспособности с помощью суправитального окрашивания водным раствором эозина.

Костномозговую взвесь заливают в два алюминиевых контейнера КВ 25808 по 30 мл и направляют на замораживание, Замораживание костного мозга осуществляют по двухэтапной программе: на первом этапе охлаждение камеры аппарата производят со ско о ростью 1 С в минуту от температуры окружающей среды до -7 С (при этом температура заморажинаеллого костноо го мозга составляет -4 С), на втоо ром — со скоростью 10 С в минуту до -196 С. Хранение замороженного костного мозга осуществляют в жидком азоте. Оттаивание костного мозга производят быстро н водяной бане с температурой 39-40 С. Берут пробу

i 34902 l

Ь 55

Пример 2 (оптимальное соотношение ингредиентов). Взвешивают

0,1 г динатрпевой соли этилендиаминJ тетрауксусной кислот„ и 1,0 г натрия на подсчет для определения количест.ва ядросодержащих клеток и определения жизнеспособности по эознну.

Результаты подсчета в пробах костного мозга до замораживания:

5 количество ядросодержащих клеток в

1 ил 1„9xIO, количество жиэнеспособс ных клеток 96Х.

Результаты подсчета в пробах !

О костного мозга после размораживания: количество ядросодержащих клеток в с

I ил 1,6xIO, количество жизнеспособных клеток 96Х.

Сохранность стволовых кроветворных клеток в размороженном костном мозге определяют с помощью метода клонирования кроветворной ткани в селезенках смертельно облученных иышай. Для этого юппей облучаит íà 20 усТановке ИПК с источником al -облучения I37c> в дозе 13 Гр при иощности дозы облучения.0,!4 Гр/мин. Через 2 ч после облучения ии вводят в хвостовую вен по 0,5 мл взвеси, 25 содержащей 1х10 клеток свежезаготовленного или размороженного костного мозга. В опыт отбирают мышей весом 20-22г. В первую контрольную группу входят облученные яппи, кото- 30

Рыи не трансплантируют костный мозг, во вторую контрольную группу - мыши, которым вводят клетки свежеэаI

1готовленного костного мозга в тех же дозировках, в тРетью гРуппу— иьппи, которым трансплантируют размороженный костный мозг.

На 9 день после облучения и трансплантации костного мозга мышей умерщвляют, селезенки извлекают, фиксируют в растворе Буэна и хранят в IOX-нои фориалине. Подсчет иакроскопически видимых колоний проводят лод бинокулярной лупой БИ-51-2 (объектив х7). В первой контрольной 45 группе количество колоний в селезенке не должно превьппать 1,0. Среднее количество колоний, образовавшееся в селезенках мышей после введения ии свежезаготовленного костного мозга, принимают эа IOOX.

Результаты исследования сохранности стволовых гемопоэтических клеток представлены в табл.1. лимонно кислого трех замешенно о, В 300 мл гемодеза растворяют зтн навески. Затем добавляют 250 мл

103-ного раствора желатина мецнцинского в ампулах для инъекций (2,5 мас.X), 70 ил глицерина и 40 мл диметилацетамида, после чего добавляют гемодеэ до конечного объема 1 л.

Определяют РН Раствора - 6,3, доводят его до 7,5 с помошью 1Он раствоРа едкого натра. Далее раствор фильтруют и стерилизуют, как описано в примере 1.

Замораживание костного мозга машей.

Заготовку костного мозга, замораживание, размораживание проводят как описано в примере 1.

Результаты подсчета в пробах кост" ного мозга до замораживания: количество ядросодержащих клеток в 1 ил— с

I,O8xlO, количество *иэнеспособных клеток — 99X. Результаты подсчета в пробах костного мозга после размораживания: количество ядросодержащих

& клеток в l мл 0,92х10, количество жизнеспособных клеток 93X..

Результаты исследования сохранности стволовых клеток представлены в табл. 1.

Замораживание костного мозга человека.

Костный мозг заготовлен у Б.Л.В., пол женский, 20 лет, путем аспирации из подвздошных костей в стерильных условиях под общим наркоэои на предлагаемом растворе в соотношении 1: I.

Чтобы предотвратить гемолиз эритроцитов в процессе замораживания, предварительно проводят отделение костномоэговых элементов от зритроцитов путем отстаивания при комнатной температуре в течение 15 мин. т

В

После отделения эритроцитов взвесь костномоэговых клеток помещают в алюминиевые контейнеры. Замораживание костного мозга проводят по двухэтапной программе. На первом этапе охлаждение камеры аппарата о производят со скоростью 1 С в минуту до температуры окружающей среды о до -9 С, на втором — со скоростью о о

10 С в минуту до †1 С. Уране:ие заморомениого костного мозга оеуп,ествляют в жидком азоте. Оттаа. :1!H— костнйГО мозга пРОпзао",пт !!i; тро В о водяной бане с температур,:и 39- 0 С.

)34902) Таблица I

Х сохранных стволовых клеток

Среднее количество колоний на селезенку

Группы waneA

Нижний предел доэнровок ингредиентов раствора

Π— 0

Контроль облучения

Для оценки биологической полноценности криоконсервированиого костного мозга использовали метод клонирования кроветворных клеток в полутвердом arape, позволяющий проводить количественное определение клеток-предшественников в свежеэаготовленном и размороженном костном мозге человека. Метод является лучшим тестом iп чltro,noýâoëÿþùèì оценивать результаты криоконсервирования костного мозга человека. К колониям относят клеточные агрегаты, содержащие более 40 клеток, от 3 до

20 клеток — к малым кластерам, от

20 до 40 клеток -. к большим кластерам. Количество колоний и кластеров на Ix)0 ядросодержащих клеток в

5 свежезаготовленном костйом мозге принимают эа 100Х. Подсчет колоний проводят на 14-е сутки культивирования.

Результаты опыта отражены в табл.2.

Пример 3. Взвешивают 0,)5 r динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 1,2 r натрия лимонно-кислого трехэамещенного. В

300 мп гемодеза растворяют эти на вески. Затем добавляют 270 мл .IOX-ного раствора желатина медицинс-, кого в ампулах для инъекций (2,7 мас,X), 74 мл глицерина н 45 мп днметилацетамида, после чего добавляют гемодеэ до конечного объема lл.

Определяют рН раствора 6,7 и доводят его до 7.,4 с помощью 10н раствора едкого натра. Далее раствор фильтруют и стерипиэуют как описано в примере 1.

Заготовку костного мозга мьаией, замораживание, размораживание проводят как описано в примере l.

Результаты подсчета в пробах костного мозга до замораживания: количество ядросодермаших клеток в

1 мл ),3x)0, количество жнэнеспособнык клеток 98Х. Результаты подсчета в пробах костного мозга после размораживания: количество ядросодержащих клеток в 1 мл ),Ox)0, количество жизнеспособных клеток 97Z.

10 Результаты исследования сохранности стволовых клеток представлены в табл.l.

Предлагаеиай раствор позволяет сохранять более высокий процент ство15 ловых гемопоэтических клеток, что подтверждается высокими результатами культивирования размороженного костного мозга человека в полутвердом агаре и клонированием раэморо20 женного костного мозга мышей в селезенках смертельно облученных машей.

Формула и э о б р е т е н и я

Состав для замораживания костного мозга, содержащий глицерин, поливинилпирролидон, медицинский желатин, этилендиаминтетраацетат натрия и

30 натрий лимонно-кислый трехзамещенный, отличающийся тем, что, с целью повышения качества состава se счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток, он до З5 полнительно содержит диметилацетамид при следующем соотношении комлонентов, мас. Х:

Медицинский желатин 2,0-2,7

Этилеиднаминтетрааце40 тат натрия 0,09-0,15

Натрий лимонно-кислый трехзамещенный 0,9-1, 2

Глицерин- 6,6-7,4

Диметипацетамид 3,5-4,5

45 6Z-ный водный раствор поливинилпирролидона Остальное

1349021

Продолжение тлбл.l

Груллы навей

IOO

63,3

Оптимальное соотношение ингредиентов раствора

Контроль облучения

100

83,3

Верхний лредел доэировок ингредиентов раствора

Контроль облучения

0 ° (00

I7,0

I53

79,(Свемеэаготовленный костный мозг

Размороженный костный мозг

Свеаеэаготовленнцй костный мозг

Размороженный костный мозг

Свеаеэаготовленный костный мозг

Размороженный костный йоэг

Среднее количество колоний на селезенку

144

12 0

l2

1 (4 7э6

106

0

144 12 0 (г!

22 . !О 1

0 mо

I29 — 21 5

Э

I сохранных стволовых клеток