Криопротектор

 

Изобретение касается криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур. Целью изобретения является повьшение степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании с использованием ы-монометилового эфира глицерина (ММЭГ) в качестве криопротектора. Тромбоциты донорской крови помещают в криозацитные среды (в виде 10%-ных растворов в плазме) ММЭГ и глицерина (в качестве сравнения). Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус с последукяцим погружением в жидкий азот. Деконсервирование проводят путем отогрева на водяной бане при . При использовании в качестве криопротектора ММЭГ сохраняется на 40Z больше клеток, чем в случае применения глицерина , при этом их ретрактильная активность на 20Z выше. 3 .табл. (Л с

.СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!91 (ill

SU (50 4 С 07 С 31/22 43/02, А 01 N 1!02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (I ( (Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3929038/28-14 (22) 12.07.85 (46) 23.03.87. Бюл. У 11 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) И.И. Шраго, Л.А. Ханина, С.В.Кощнй, С.Ю. Видный, В.Ф. Карташов, В.К. Masanos. П.А. Пустовойт, А.М.Компаннец, А.В. Николенко, Е.Г. Атовмян, Л.З. Верховская и В.М. Гучок (53) 616.07(088.8) (56) Пушкарь Н.С. и др. Криопротекторы. " Киев: Наукова думка, 1978, с ° 32-54. (54) КРИОПРОТЕКТОР (57) Изобретение касается криобиологии и может быть использовано прн низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур. Целью изобретения является повыпение степени защиты биологических объектов при их ниэкотемпературном консервировании с использованием ы-монометилового эфира глицерина (ИИЗГ) в качестве крнопротектора. Тромбоциты донорской крови помещают в криозащитные среды (в виде 10Х-ных растворов в плазме) ИИЭГ и глицерина (в качестве сравнения).

Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус 70 С с последующим погружением в жидкий азот.

Деконсервирование проводят путем отогрева на водяной бане при 37 С. При использовании в качестве криопротектора ИИЭГ сохраняется нв 40Х больше клеток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20Х выше. 3 .табл.

t 129820

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур.

Целью изобретения является повышение степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании. t0

Эта цель достигается применением

4-монометилового эфира глицерина (ИИЭГ) формулы

СН вЂ” СН вЂ” СН ! !5

ОН ОН ОСН в качестве криопротектора.

По международной классификации (1961 г.) данное соединение имеет название З-метокси-l,2-пропандиол.

Hp и м е р 1. Тромбоциты выделяют из донорской крови методом дифференцированного центрифугирования.Крио-. защитные среды готовят в виде 10Х-ных растворов глицерина и ИМЭГ в плазме. 25

K тромбоконцентрату, содержащему 2

10 клеток/мл, добавляют медленно криозащитные растворы в соотношении

1:1, так,.что конечная концентрация глицерина и ММЭГ была 57.. 30

Замораживание осуществляют со скоростью 1.0 град/мин до минус 70 С с последующим погружением в жидкий азот.

Деконсервярование проводят путем отогрева на водяной бане при 37 С.

Иорфофункциональные.свойства тромбоцитов после размораживания оценивают путем подсчета общего количества клеток в камере Горяева, а также по показателям ретрактильной и агрегаци- << онной активности (табл. !).

Т а блица 2 тор

7,5

Таблица!

Криопротектор

Показатели

83Х 917

577. оличест Ретрак о тром- тильна оцитов, активX ность, Стеень агрегации 5О

5% МИЭГ

5Х глицерин

90+2

55+2

18+4

35+3

50+5

Из табл. 1 видно, что при использовании в качестве криопротектора

ИИЭГ сохраняется на 40Х больше кле3 2 ток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20% вьппе.

Пример 2. Клеточную взвесь. костного мозга разводят в соотношении 1;1 с МИЭГ.и глицерином, приготовленными на дистиллированной воде до конечной концентрации криопротекторов 5; 7,5; 15Х.

Концентрация клеток, определенная в камере Горяева, составляет 2,06 х х 10 кл/мл.

После 15-минутной эквилибрации клеточную взвесь разливают по 1,5 мл в полиэтиленовые контейнеры и запаивают.

Замораживание осуществляют по двух этапной программе: со скоростью 1

1 град/мин до минус 15 С, выдержка

3 мин при минус 15 С, далее до минус

80 С со скоростью 10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот.

После 15. сут хранения при азотной температуре минус 196 С отогрев проводят на водяной бане при 40 С до исчезновения твердой фазы.

Жизнеспособность клеток костного мозга определяют по методу Шрека.

Результаты представлены в табл.2.

В табл, 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности

ИИЭГ и. глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию клеток 2 10 мл.

Крио- Конечная концентрация криопротек- протектора, Х,15 ММЭГ 11400 275 16640+580 18120+500

Глице- 4920+1 50 11220 "440 14300+470 рин

257 567 717.

Из табл. 2 видно, что при использовании в качестве криопротектора

ММЭГ жизнеспособных клеток на 20-30Х больше, чем в случае применения глицерина.

Равноценный криозащитный эффект достигается применением более низких

3 12982 концентраций предлагаемого криопротектора. Так, 80 жизнеспособных кле- ток костного мозга после замораживания можно получить применением 7,5 .— ным раствором ММЭГ. тогда как такой же эффект сохранности достигается применением 15Х-ного раствора глицерина.

Сравнительное исследование криозащитной активности глицерина и ММЭГ 10 было проведено на перевиваемой культуре клеток почки теленка (ПТ).

Пример 3. Сформировавшийся монослой клеток перевиваемой линии почки теленка в хорошем морфологичес- 15 ком состоянии снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 9:1. Клеточную взвесь собирают в один сосуд, измеряют ее объем, берут пробу для подсчета кон- 20 центрации клеток в камере Горяева.

К суспенэии клеток в соотношении

1:1 при постоянном перемешивании добавляют 20 или 10Х-иый раствор ММЭГ или 20Х-ный раствор глицерина питательной среде, содержащей: 0,5Х-ный гидролизат лактальбумина на растворе

Хенкса 45 ; среда 199 45Х; сыворотка крупного рогатого скота 10 ; канамицина сульфат 100 мкг/мл. Концентра- 30 ция клеток составляет 2,1 10 мл.

Затем клеточную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и запаивают.

Эквилибрацию клеток с криозащитной средой Осуществляют в течение 1,5 ч при 4С. Охлаждение проводят в программном замораживателе: на первом этапе со скоростью 1 град/мин до минус 40

30 С, на втором — 5 град/мин до минус

70 С, после чего ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в жидкий .азот (минус 196 С).

После 20-дневного хранения осуществляют деконсервацию клеток путем отогрева на водяной бане при 37 С. Размороженные клетки переносят в культу- ральные флаконы, добавляя питательную50 среду до посевной концентрации клеток (2,1-10 /мл). Культивирование осуществляют при 37 С, производя че03 4 рез одни сутки замену среды для удаления криопротектора.

Сохранность клеток оценивают методом суправитального окрашивания

0,2 -ным раствором трипанового синего, а также по динамике и характеру формирования монослоя.

Концентрация клеток культуры ПТ и их жизнеспособность в суспензии, подвергнутой криоконсервации под защитой глицерина и ММЭГ, приведена в табл.3.

Т а б л и ц а 3

Криопро- Концентрация тек тор изнеспособость крио протекклеток, 10 тора

Глицерин 1О 16,2+1,2 74,0+2,2

10 17,6+0,6 75,0+1,4

5 18,0+1,6 82,0+1,1

ММЭГ

Применением -монометилового эфира глицерина в качестве криопротектора.

Из данных, представленных в табл.3, следует, что ММЭГ в меньшей, чем глицерин концентрации оказывает более выраженный криозащитный эффект в отношении клеток перевиваемой культуры

ПТ.

По истечении 4 сут культивирования монослой клетками бып выполнен на

100Х поверхности культурального сосуда.

Клетки имеют полигональную форму с хорошо выраженными границами, не теряют способности пассироваться. В течение 3 пассажей они без каких-либо трудностей снимаются со стекла и пересеиваются.

Иэ приведенных примеров 1-3 следует, что предлагаемый криопротектор

ММЭГ обладает более высокой степенью защиты, чем глицерин, при этом он менее токсичен.

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 857/24 Тираж 372 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4