Способ определения сиаловых кислот в биологическом материале

 

Изобретение относится к биохимии , предназначено для исследования биохимических процессов в организме человека и животных и для диагностических и прогностических целей в клинической практике. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа . Исследуемый материал гидролизу-, ют в 0,05 М растворе серной кислоты . при 80 С 1 ч. При этом происходит освобождение сиаловых кислот, входящих в состав гликопротеидов и гликолипидов исследуемой пробы. После охлаждения гидролизат подвергают периодатному окислению, добавляя раствор 0,025М йодной кислоты на 0,125 М НС1 до конечной концентрации 5 ммоль/л. Избыток йодной кислоты,- мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной или ацетилтиомочевиной. Измеряют оптическую плотность окрашенной верхней органической фазы при 550 нм на спектрофотометре. Концентрацию сиаловой кислоты рассчитьшают по калибровочному графику. 1 фиг. СО ел ел со со со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4019770/28-14 (22) 04.02.86 (46) 30.11.87. Бюл. ¹ 44 (71) Кишиневский государственный медицинский институт и Молдавский научно-исследовательский институт кардиологии (72) В.С,Гудумак, В.И.Опря, М.И.Попович и А.И.Сауля (53) 616.015 (088.8) (56) Morgan I.Е. — Clin Chim. Acfa, 1981, Ч.116, р. 409. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к биохимии, предназначено для исследования биохимических процессов в организме человека и животных и для диагностических и прогностических целей в клинической практике. Цель изобретеSU 135 А1 (5t)4 С 01 N 33/52 ния — повышение чувствительности способа. Исследуемый материал гидролизу-, ют в 0,05 M растворе серной кислоты о при 80 С 1 ч. При этом происходит освобождение сиаловых кислот, входящих в состав гликопротеидов и гликолипидов исследуемой пробы. После охлаждения гидролизат подвергают периодатному окислению, добавляя раствор 0,025 M йодной кислоты на 0,125 M НС1 до конечной концентрации 5 ммоль/л. Избыток йодной кислоты, мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной или ацетилтиомочевиной. Измеряют оптическую плотность окрашенной верхней:органической

CO фазы при 550 нм на спектрофотометре.

Концентрацию сиаловой кислоты рассчитывают по калибровочному графику.

1 фиг, 13559

Изобретение относится к области биохимии, а именно к анализу биологических объектов, и может быть использовано при исследовании биохимических

5 процессов в организме человека и животных, а также в клинической практике для диагностических и прогностических целей.

Цель изобретения — повышение чув10 ствительности способа.

На чертеже представлен калибровочный график.

Способ осуществляют следующим образом. 15

Исследуемый материал подвергают гидролизу в 0,05 M растворе серной о кислоты при 80 С в течение 60 мин.

При этом происходит освобождение сиаловых кислот входящих в состав глиУ

20 копротеидов и гликолипидов исследуемой пробы.

После охлаждения до комнатной температуры гидролизат подвергают периодатному окислению. Для этого к определенному объему гидролизата, содержащего 3 — 25 нмоль сиаловой кислоты, добавляют свежеприготовленный раствор 0.,025 М йодной кислоты в 0,125 М

НС1 до конечной концентрации 5ммоль/л; пробу перемешивают и выдерживают

30 мин при 37 С.

Избыток йодной кислоты,, мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной или ацетилтиомочевиной, которые добавляют к исследуемой пробе в концентрации

44-88 и 38-75 ммоль/л соответственно.

Пробу перемешивают, после чего вносят 39-50 мкмоль/л 2 тиобарбитуровой

40 кислоты (рН 9, 0), опять перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на

7-10 мин. Затем пробу охлаждают 12 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают в термостате при о 45

37 С, после чего окраску экстрагируют бутанолом, содержащим 0,69-1,03 моль/л о-фосфорной кислоты. Экстракцию осуществляют энергичным встряхиванием пробы с последующим центрифугированием при 2000-3000 об/мин в течение

3-5 мин.

Окрашенную верхнюю органическую фазу отделяют и измеряют ее оптическую плотность при 550 нм на спектрофотометре. Контропем в данном случае является 0,05 М раствор серной кисло— ты. обработанный подобным образом.

33 ь

Концентрацию сиаловой кислоты рассчитывают по калибровочному графику.

Способ поясняется следующими примерами.

II p и м е р 1. Количественное определение сиаловой кислоты в сыворотке крови с использованием тиомочевины.

В центрифужную пробирку вносят

0,8 мл 0,05 M раствора серной кислоты и 0,005 мл исследуемой сыворотки, накрывают сверху стеклянной пробкой и пробирку помещают в термастат при

80 С на 60 мин. По окончании гидролиза пробу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 0,2 мл 0,025 М раствора йоцной кислоты в О, 125 M

НС1, перемешивают и выдерживают в о термостате 30 мин при 37 С. Затем прибавляют 0,2 мл 2,57.-ного водного раствора тиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 1,0 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 М раствором NaOH до рН 9,0. Пробу накрывают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на

10 мин. После этого пробу охлаждают

2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают ее в термостате о при 37 С. Образовавшийся окрашенный продукт (хромоген) экстрагируют 2 мл н-бутанола, содержащего 52 по объему

85%-ной о-фосфорной кислоты. Экстракцию осуществляют путем энергичного встряхивания пробы с последующим ее центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спект 7 рофотометре СФ-26 при 550 нм против холостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но сыворотки не содержит. Окраска устойчива в течение нескольких часов.

Поскольку объем органической фазы с недостаточен для наполнения стандартной кюветы (10 мм) спектрофотометра

СФ-26, при измерениях оптической плотности необходимо испольэовать оптическую приставку для фотометрии малых объемов раствора.

Концентрацию сиаловых кислот в исследуемой сыворот ке рассчитывают по формуле

Х= а 0,2 (1) 55933 з 13 где а — найденное по калибровочному графику количество сиаловой кислоты в исследуемой пробе;

0,2 — коэффициент пересчета.

Для построения калибровочного графика готовят ряд.разведений основного стандартного раствора, содержащего

100 мг/л (323,3 ммоль/л) сиаловой кислоты. Каждое рабочее разведение обрабатывают, как описано выше..Холостую пробу обрабатывают аналоги гно, но вместо рабочего разведения сиаловой кислоты используют 0,8 мл 0,05 М раствора серной кислоты. После измерения оптической плотности растворов строят калибровочный график (см. четтеж).

Оптическая плотность (П) исследуемого образца сыворотки крови 0,300.

По калибровочному графику находят количество сиаловых кислот (в данном случае a=10,81 нмоль). Далее по формуле (1) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемой сыворотке (2,16 ммоль/л) .

Пример 2 ° Количественное определение сиаловых кислот в сыворотке крови с использованием ацетилтиомочевины.

Предварительный гидролиз исследуемого образца сыворотки крови и периодатное окисление пробы проводят аналогично примеру 1 ° Далее в пробу вносят 0,8 мл 1,5 -ного раствора ацетилтиомочевины, взбалтывают, добавляют 0,4 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 Yi раствором Na0H до рН 9,0, накрывают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько же. выдерживают в о термостате при 37 С, добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5Х по объему

851-ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 550 нм против холостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но сыворотки не содержит. Окраска устойчива в течение нескольких часов.

Оптическая плотность исследуемого образца сыворотки крови Д=0,540. По калибровочному графику находят количество сиаловых кислот (в данном случае а=17,93 нмоль). Далее по формуле (1) вычисляют концентрацию сиаловой кислоты в исследуемой сыворотке (3,59 ммоль/л).

Пример 3. Количественное определение сиаловых кислот в эритроцитах с использованием тиомочевины.

Гепаринизированную кровь центрифугируют при 3000 об/мин 7 мин, плазму и верхний слой осадка форменных элементов, содержащий преимущественно лейкоциты, удаляют. Затем осадок эритроцитов трижды промывают 0,9Х-ным раствором хлористого натрия путем центрифугирования при описанном режиме.

В центрифужную пробирку берут

2р 0,1 мл эритроцитарной массы, добавляют 0,7 мл 0,9Х-ного раствора NaC1 и 1 мл О, 1 М раствора соляной кислоты, тщательно перемешивают, накрывают сверху стеклянной пробкой и проо

25 бирку помещают в термостат при 80 С на 60 мин. По окончании гидролиза о пробу охлаждают до комнатной температуры, после чего добавляют 0,1 мл

30 .-ного раствора К4Ге(СИ) 3Н О и

ЗО 0,1 мл 40Х-ного раствора уксуснокислого цинка, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин. В другую чистую пробирку отбирают 0,8 мл прозрачной на35 досадочной жидкости, добавляют 0,2мл

0,025 М раствора периодата натрия в

О 5 M растворе серной кислоты и выЭ о держивают 30 мин при 37 С.

Затем прибавляют О, 2 мл 2, 5 -ного

40 раствора тиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 1,0 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 И раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 М раствором NaOH до рН 9,0. Пробу нак45 рывают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на

10 мин. Затем пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько же о выдерживают в термостате при 37 С, 50 добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5Х по объему 85 -ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спект55 ,рофотометре СФ-26 при 550 нм против холостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но эритроцитов не . содержит (вместо эритроцитарной массы

55933 Ь

По калибровочному графику находят количество сиаловой кислоты (в данном случае а=10,46 нмоль). Далее по фор5 муле (2) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемом образце, эритроцитов (261,5 мкмоль/л).

Предлагаемый способ достаточно специфичен, воспроизводим, дает пра10 вильные результаты, обладает большей чувствительностью по сравнению с известным способом. Использование тиомочевины и ацетилтиомочевины повьппает чувствительность предлагаемого способа на 20 и 26 соответственно.

Это позволяет более тонко улавливать изменения концентрации сиаловой кислоты в организме при различных патологических состояниях, Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с известным является менее токсичным, поскольку исключает„ использование сильноядовитого арсеннта натрия, а также высоколетучей, 25 агрессивной смеси бутанола с соляной кислотой.

5 13 берут О, 1 мп 0,9%-ного раствора ЙаС1).

Концентрацию сиаловой кислоты в эритроцитах рассчитывают по формуле

Х = а 25, (2) где а — найденное по калибровочному графику количество сиаловой кислоты в исследуемой пробе;

25 — коэффициент пересчета.

Оптическая плотность исследуемого образца эритроцитов донора Д=0,370.

По калибровочному графику находят количество сиаловой кислоты (в данном случае а=13,32 нмоль). Далее по формуле (2) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемом образце эритроцитов, (333,0 мкмоль/л).

Пример 4. Количественное определение сиаловой кислоты в эритроцитах с использованием ацетилтиомочевины.

Получение эритроцитарной массы, гидролиз и периодатное окисление пробы проводят аналогично примеру 3.

Далее избыток периодата разрушают добавлением 0,8 мл 1,5 .-ного раствора ацетилтиомочевины, пробу:взбалтывают, вносят 0,4 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 М раствором

Na0H до рН 9,0, накрывают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают в термостате при 37 С, добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5X по объему

85 .-ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 550. нм против холостой пробы, которая обрабатываетая, как и опытная, но эритроцитов не содержит (вместо эритроцитарной массы берут 0,1 мл 0,9%-ного раствора NaC1) .

Оптическая плотность исследуемого образца зритроцитов донора Д=0,315, Формула изобретения

30 Способ определения сиаловых кислот в биологическом материале путем его гидролиза серной кислотой, обработки иодной кислотой, разрушения избытка иодной кислоты, добавления тиобарби35 туровой кислоты с последующей экстракцией окрашенного продукта бутанолом и спектрофотометрирования, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, разрушение избытка иодной кислоты осуществляют добавлением тиомочевины в конечной концентрации 4488 ммоль/л или ацетилтиомочевины в конечной концентрации 88-75 ммоль/л, 45 тиобарбитуровую кислоту берут в концентрации 39-50 мкмоль/л, а в бутанол дополнительно вводят о-фосфорную кислоту в конечной концентрации 0,691903 моль/лю

1355933 юм лэ

Составитель Н. Гуляева

Редактор Л.Веселовская Техред А.Кравчук

Корректор А.Зимокосов

Заказ 5789/40 Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4