Способ определения в крови гликозилированных соединений, содержащих кетоаминовую связь

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Цельную кровь и щавелевую кислоту нагревают . После охлаждения добавляют трихлоруксусную кислоту и центрифугируют . К надосадочной жидкости добавляют тиобарбитуровую кислоту и инкубируют. Измеряют величину адсорбции и определяют фоновые значения адсорбции. Рассчитьюают количество гликозилированного гемоглобина по калибровочному графику. 2 табл. со 4 «

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1347014 д1 (д) 4 G 01 N 33/48, 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4023174/28-14 (22) 12.02.86 (46) 23.10.87. Бюл. У 39 (71) Институт биологической и медицинской химии ANH СССР (72) В.К,Городецкий и E.À.Êàðïîâà (53) 612.015 (088.8) (56) Pecoraro R.Å., Graf R.Т. На1ter Т.В..et, a1, Diabetes, 28, N 12, рр. 1120-1125, 1979. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В КРОВИ ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ КЕТОАМИНОВУЮ СВЯЗЬ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа. Цельную кровь и щавелевую кислоту нагревают. После охлаждения добавляют трихлоруксусную кислоту и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют тиобарбитуровую кислоту и инкубируют.

Измеряют величину адсорбции и определяют фоновые значения адсорбции. Рассчитывают количество гликозилироваиного гемоглобина по калибровочному графику. 2 табл.

1 134

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть испольэова7014 но в клинико-диагностических исследованиях эндокринологического профиля.

Цель изобретения — повьцление точности и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом, Проводят забор крови, пробу крови гемолизируют водой, добавляют щавелевую кислоту, нагревают, охлаждают, обрабатывают трихлоруксусной кислотой, отделяют белки, а супернатант обрабатывают тиобарбитуровой кислотой. Затем пробы спектрофотометрируют, а расчет ведут по калибровочному графику, построенному по фруктозоглицину, Таблица1

Концентрация ФГ в пробе, моль/л

0714285684112140169204

0,35 0,53 0,71 0,90 1,07 1,30

К 1,0 мл цельной крови добавпяют

0,9 мл дистиллированной воды и

0,5 мл 1,0 ц. щавелевой кислоты и нагревают в течение 4 ч на кипящей водяной бане в запаянных ампулах.

После охлаждения добавляют 0,5 мл

40Х-ной трихлоруксусной кислоты.

Смесь центрифугируют 10 мин при

7800 об/мин. К 1,0 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл 0,05 м тиобарбитуровой кислоты и ннкубируют

30 мин при 40 С. После инкубации измеряют величину абсорбции (А) при

443 нм. Поскольку работа ведется с цельной кровью, необходимо определение фоновых значений А. Определение

A,N ïðoâoäÿт аналогично указанным ойерациям, исключая стадию кислотного гидролиза. Расчет количества гли" козилированного гемоглобина ведется по калибровочному графику.

Концентрацию суммарного гемоглобина в крови определяют по гемоглобинциачндному методу. По полученной оптической плотности (А=А„ „ -А,„ ):

Оптическая плотность 0,05 0,09 ÎÄ 17

Пример. Для построения калибровочного графика по фруктозоглицину (ФГ) готовят стандартные растворы, содержащие 0,7; 1,4; 2,8; 5,6 8,4;

11,2; 14,0; 16,9; 20,4 моль/л ФГ в пробе соответственно, что соответствует 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 145 мкг в пробе. К пробам, содержащим по 1,0 мл приготовленных растворов, добавляют по 0,5 мл 1,0 н.щавелевой кислоты и нагревают в течение 4 ч на кипящей водяной бане. Затем отбирают по 1,0 мл, добавляют 0,5 мл тиобарбитуровой кислоты и инкубируют 30 мин при 40

Измерение оптической плотности провоцят при 443 нм. Результаты измерений приведены в табл.1.!

3g по стандартному графику "Фруктозоглицин" находим концентрацию соединений, содержащих кетоаминовую смесь в пробе, выраженную в виде концентрации фруктозоглицина (С „), 40 Содержание гликозилированного гемоглобина в пробе определяют по формуле — — -" 100K 3

С юг

2С„, где С „— концентрация кетоаминов в пробе, молb/ë;

С „, — концентрация суммарного . гемоглобина, моль/л; .

2 — коэффициент, учитывающий

50 что одна молекула гемоглобина связана с двумя: молекулами фруктозы (молекула гемоглобина имеет две субъединицы, каждая из которых состоит из са вЂ, P -цепей, а гликозилирование протекает только по концевому валину Р-цепи) .

-В качестве конкретного примера приведено определение содержания гли4

Продолженре табл.2

Фрук тоз оаминокислоты: фруктозоглицин 0,1 0,03 0,320 фруктозоал анин

0,1 0,03 1,000

Цельная кровь 0,1 0,16 0,298

Таблица 2

Формула изобретения

Способ определения в крови гликолизированных соединений, содержащих кетоаминовую связь, путем отбора кро ви, добавления к пробе щавелевой кислоты, нагревания, осаждения белков, 3О центрифугирования, добавления тиобар" битуровой кислоты и инкубации с последующим спектрофотометрированием и расчетом по калибровочной кривой, отличающийся тем, что, 35 с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве биологического материала используют цельную кровь, а в качестве стандарта при построении калибровочной кривой при40 меняют фруктбзоглицин.

Белки: гликозилированный гемоглобин

О, 15 0,900

0,1 гликолизированный альбумин

0 15 0,460

0,1

Составитель Н. Гуляева

Техред А.Кравчук

Корректор А.Зимокосов

Редактор А.Козориз

Заказ 5116/43 Тираж 775

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4

13470 козилированного гемоглобина в крови ,больного диабетом.

В результате гидролиза пробы крови получена оптическая плотность А„ро „ =

=0,385; А,О„„=0,087, А Адр„

А,„„=Q, 298. По калибровочному графику А = 0,298 соответствует концентрации соединений, содержащих кетоаминовую связь, выраженную в концентрации фруктозоглицина С „=4, 78 10 моль/л.

Концентрация суммарного гемоглобина ,С„ =15,4 г% или 2,4 10 моль/л.

Подставляя полученные значения в формулу, получаем содержание гликозилированного гемоглобина, равное

10Х.

В табл.2 представлены данные, под тверждающие возможность определения, наряду с гликозилированным гемоглобином, и других гликозилированных соединений.

Таким образом, проведение расчета по стандартной кривсй "Фруктозогли-. цин" повышает точность метода в 2,4 раза, переход с эритроцитарной массы на цельную кровь значительно упрощает проведение анализа.