Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных

 

Изобретение относится к акушерству , точнее к способам количественного определения прогестерона в сыворотке крови животных и человека, касается дифференциальной диагностики бесплодия и контроля за его лечением. наблюдения за протеканием беременности , выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей. Цель изобретения - сокращение времени анализа до 3-4 ч и его упрощение. Для этого - предложен способ псевдогомогенного иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных, заключающийся в том, что свободный прогестерон и прогестерон, меченный пероксидазой хрена, инкубируют с антителами к прогестерону, добавляют к смеси полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ бООО), центрифугируют и в осадке определяют активность связанной пероксидазы по окислению ортодианизидина перборатом натрия или перекисью водорода. По калибровочной зависимости находят коцентрацию прогестерона . Способ позволяет безэкстракционным путем определять микролсоличества прогестерона и сократить время анализа. СО 00 о ts5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (S11 4 6 01 1 1 33/535 йС ГЛ -я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ наблюдения за протеканием беременности, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей. Цель изобретения — сокращение времени анализа до

3-4 ч и его упрощение. Для .этого . предложен способ псевдогомогенного иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных, заключающийся в том, что свободный прогестерон и прогестерон, меченный пероксидазой хрена, инкубируют с антителами к прогестерону, добавляют к смеси полиэтиленгликоль

6000 (ПЭГ 6000), центрифугируют и в осадке определяют активность связанной пероксидазы по окислению ортодианизидина перборатом натрия или перекисью водорода. По калибровочной зависимости находят коцентрацию прогестерона. Способ позволяет безэкстракционным путем определять микро оличества прогестерона и сократить время анализа.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4041361/28-14 (22) 24.03.86 (46) 15.03.88. Бюл. 11 - 10 (71) Институт биоорганической химии AH БССР (72) В.Д. Артемчик, M.È. Савенкова, Д.И. Метелица, В.Д. Матвеенцев, Н.В. Пивень и H.Ю. Шостак (53) 615.373(088.8) (56) Munro С., Stabefeldt G. Develo

ment of a microtitre plate enzyme

immunoassay for the determination

of progestегоne. — J. Endocrinol., 1984, vol.lol, N.1, р. 41-49. (54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕД1

ЛЕНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к акушерству, точнее к способам количественного определения прогестерона в сыворотке крови животных и человека, касается дифференциальной диагностики бесплодия и контроля за его лечением,,. Я0 1381402 А 1

1381402

Изобретение относится к способам ,количественного определения! гесте- рона в сыворотке крови человека и животных и может быть использовано для дифференциальной диагностики бесплодия и контроля эа его лечением, наблюдения за протеканием беременности, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей.

Цель изобретения — сокращение времени анализа до 3-4 ч и его упрощение.

Пример 1. Получение антисыворотки к прогестерону (Анти-!I-ПРОГ).

Получают коньюгат БСА-ПРОГ, растворяют 50 мг (0,72 мкмоль) БСА в

5 мл О,l М раствора NaÍÑÎ (рН 8,35) и добавляют 25 мг (48,6 мкмоль) ПРОГ в 5 мл диметилформамида. Перемешивают о смесь 20 ч при 20 С. Конечные концентрации добавленных веществ в растворе: БСА 6 мг/мл, ПРОГ 2,5 мг/мл, 50 об.7 диметилформамида. Непрореагировавшее производное прОгестерона удаляют диализом коньюгата БСА-ПРОГ против дистиллированной воды до исчезновения в диализате поглощения прогестерона на длине волны 250 нм.

Количество связавшихся с БСА молекул прогестерона определяют . спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность раствора коньюгата на длинах волн 250 и 280 нм и используя при расчете коэффициент молярной экстинк-1 -1 ции прогестерона, равный 1,5"10 M см (21). В работе используют коньюгат

БСА-ПРОГ, содержащий 35-40 молекул прогестерона на I молекулу БСА.

Антисыворотку к прогестерону получают многократной иммунизацией кроликов смесью общим объемом 1 мл, содержащей I мг коньюгата БСА-ПРОГ, 0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда, по следующей схеме: 1-й месяц еженедельно, затем ежемесячно. Через 5-8 мес берут кровь на тестирование. Кровь берут на 7-10-й день после последней иммунизации из краевой вены уха кроо лика, выдерживают ее при 37 С и 18о

20 ч при 4 С, центрифугированием отделяют сыворотку и используют ее в дальнейшей работе.

Проведение анализа.

В пробирке, содержащей по 0,1 мл раствора прогестерона в забуференном физиологическом растворе (ЗФР 0,1 М

КН РО, 0,15 M NaC1 рН 7,4) с разными концентрациями от 10 до 1О 9 М, добавляют 0,02 мл раствора коньюгата

ПХ-ПРОГ в ЗФР с концентрацией 1,43 нМ и 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону с разбавлением 1:60 (конечное разбавление в инкубационной среде 1:420). Смесь инкубируют о

Ip 60 мин и при 20 С. К смесям добавляют 0;28 мл 257.-ного раствора ПЭГ

6000 в ЭФР с рН 7,4 и спустя 20 мин центрифугируют смеси при 8000 об/мин в течение 7 мин. Осадок отделяют и

15 ресуспендируют в 2,8 мл цитратноацетатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,34 M ортодианизидина и О,l

Твина 20, добавляют 0,2 мл того же буфера, содержащего 1,07 мМ пербора20 та натрия и в термостатированной кювете спектрофотометра "Speco 1-20" (ГДР) регистрируют в течение 30 с оптическую плотность раствора при

460 нм. Расчитывают начальную скорость реакции окисления ортодианизидина (о-ДА) для каждой из систем, содержащих разные концентрации прогестерона. Строят калибровочную зависимость в координатах начальная скорость реакции — логарифм концентрации прогестерона., Аналогично описанному обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона, и после вычисления начальHblx скоростей окисления о-ДА по калибровочной зависимости определяют концентрацию прогестерона в пробе. Способ анализа позволяет определять прогестерон в интер40 вале концентраций 10 — 10 Г1.

Пример 2. Антисыворотку к прогестерону получают аналогично примеру l. В пробирки, содержащие по

0,1 мл растворов в ЗФР прогестерона

45 с разными концентрациями, добавляют

0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным раэбавлением 1:252 и выдерживают смеси I ч при 20 С. Затем во все пробирки добавляют по 0,02 мл раствора коньюгата ПРОГ-ПХ в ЗФР с концентрацией

33,0 нМ (конечная концентрация

4,71 нМ) и инкубируют смеси еще ч при той .же температуре. Во все пробирки добавляют по 0,28 мл раствора

ПЭГ 6000 в ЗФР с концентрацией 257 (конечная концентрация 16,667) и ино кубируют смеси 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при

1381402

Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных путем инкубирования свободного прогестерона и прогестерона, меченого .пероксидазой хрена, с антителами к прогестерону, разделения свободной и связанной форм и последующего определения концентрации прогестерона по активности пероксидазы хрена, о т л и ч а ю — . шийся тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубирование прогестерона с антителами к нему проводят в растворе, а для разделения связавшихся и несвяэавшихся с антителами антигенов используют полиэтиленгликоль 6000.

ВНИИПИ Заказ I!81/40 Тираж 847

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

8000 об/мин в течение 7 мин. Супернатант удаляют, осадок растворяют, добавляя 2,8 мл цитратно-ацетатного буфера с Рн 6,0, содержащего 0,1 вес,р

Твин 20, затем в системы добавляют

0,1 мл раствора (о-ДА) в диметилформамиде (ДМФ) до концентрации 0,4 мМ и 0,1 мл раствора пербората натрия до концентрации I,O мМ и при 20 С в кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей раствора. Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах и делят 15 на величину начальной скорости реакции окисления о-ДА в контрольной системе, не содержащей прогестерона.

Строят калибровочную зависимость относительная скорость окисления 20 о-ДА в Ж к контрольной — логарифм концентрации прогестерона.

Аналогично обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона в растворах, и после 25 вычисления начальных скоростей окисления о-ДА в 7. к контрольной определяют искомые концентрации прогестерона по калибровочной зависимости.

Предлагаемый способ анализа позволяет 30 определять прогестерон в интервале концентраций 10 -10 моль/л.

Пример 3. В пробирки, содержащие 0,05 мл человеческой сыворотки с нулевой концентрацией прогестерона, 35 добавляют 0,05 мл растворов прогестерона в ЗФР с разными концентрациями от 3 >!О до 1,2 ° 10 М и по 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным разбавлением 40

1:532 и выдерживают смеси ч при о

20 С. Затем во все пробирки добавляют 0,02 мл раствора коньюгата ПХ-ПРОГ в ЗФР с концентрацией 33,0 нМ (конечная концентрация 4,71 нМ) и инкуби- 45 руют смеси еще 1 ч при той же температуре. Во все пробирки добавляют

0,28 мл раствора ПЭГ 6000 в ЗФР с концентрацией 257 (конечная концентрация 16,667) и инкубируют смеси о, 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при .8000 об/мин в течение 7 мин. Супернатант удаляют, осадок растворяют, добавляя 2,8 мл цитратно-ацетатного буфера с РН 6,0, содержащего О,l вес.7 Твина 20, затем в системы добавляют O,l мл раствора о-ДА в ДМФ до концентрации

0,4 мМ и O,l мл раствора пербората натрия до концентрации 1,0 мМ, и при о

20 С в кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей растворов. Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах.

Строят калибровочную зависимость начальная скорость окисления о-ДА— логарифм концентрации прогестерона.

Предлагаемым способом анализа можно определять прогестерон в интерва-5 ле концентраций IO -10 моль/л.

Предложенный способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови позволяет безэкстракционным путем определять микроколичества прогестерона и сократить время анализа до 2 ч при конкуретной схеме его проведения и до 3 ч при проведении анализа по схеме с поздним добавлением меченого пероксидазой прогестерона. Прй этом достигается чувствительность до 10 моль/л.

Формула и э о б р е т е н и я