Штамм bacillus thuringiensis var dendrolimus для производства дендробациллина

 

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано для производства энтомопатогенного препарата - дендробациллина. Штамм обеспечивает продуктивность до 11,8 · 10⁹ спор/мл и не образует экзотоксина, токсичного для теплокровных животных. Съем готового продукта с 1 м³ среды увеличивается при использовании данного штамма на 3 кг. 3 табл.

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано для производства энтомопатогенного препарата дендробациллина, применяемого в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с вредными насекомыми. Целью изобретения является получение штамма Bacillus thuringiensis var. dendrolimus, обладающего высокой продуктивностью спорокристаллического комплекса. Штамм получен в результате действия нитрозогуанидина и последующей селекции по признаку увеличения выхода спорокристаллического комплекса из производственного штамма 49-8. Штамм хранится в коллекции культур ВНИИ прикладной микробиологии и депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ-В-3252. Полученный штамм B. thuringiensis var. dendrolimus В-3252 имеет следующие морфологические характеристики. Вегетативные клетки представляют собой прямые палочки с закругленными концами, расположенные единично, парами или цепочками из 3-4 клеток. Размеры клеток 1,4-1,6х3,5-6,6 мкм. Грамположительные, слабо подвижные, перетрихии. В стационарной фазе развития образуют овальные споры величиной 1,4-2,2х1,1 мкм, расположенные терминально, не раздувающие спорангии, и энтомоцидные белковые кристаллы правильной ромбовидной формы. Соотношение спор и кристаллов 1:1. Характер роста на различных питательных средах. На мясопептонном агаре образует кремовато-белые колонии, каплевидные гладкие, пастообразной консистенции. На мясопептонном бульоне образует сплошную гладкую пленку. На сухом питательном агаре рост обильный, колонии белые, каплевидные, пастообразные, при старении поверхность становится морщинистой. Пигмента не образует. На молочном агаре рост обильный, образует гладкие белые колонии с зоной просветления агара (вследствие гидролиза казеина молока) 4-6 мм. На желточной среде рост обильный, колонии белые, гладкие. Вследствие образования лецитиназы и расщепления лецитина желтка происходит побеление среды вокруг колоний. На ломтиках картофеля рост обильный. Налет слизистый, блестящий, гладкий. Пигмент не образуется. Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Усваивает с образованием кислоты без выделения газа глюкозу, мальтозу, целлобиозу, глицерин. Слабо усваивает сахарозу, маннозу, ксилозу. Не усваивает салицин, лактозу, арабинозу, маннит. Разлагает эскулин. Образует ацетилметилкарбинол. Отношение к источникам азота. Усваивает аммонийные формы азота. Восстанавливает нитраты. Молоко пептонизирует. Желатин разжижает. Мочевину не разлагает. Антигенные свойства. Относится к IV серотипу культуры B. thuringiensis (Н4а Н4в). Патогенные свойства. Токсичен для личинок непарного шелкопряда. Не продуцирует термостабильный β-экзотоксин. Не обладает патогенностью для теплокровных животных. Отношение к фагам. Устойчив к производственным фагам М, Кр, И-77, Д5, Д2, Д3. Собственных вирулентных фагов не выделяет. П р и м е р 1. Штамм В-3252 выращивают на регламентной дрожжеполисахаридной среде (ДПС) следующего состава, мас. кормовые дрожжи (БВК) 3,0; кукурузная мука 1,5; NaCl 0,5; вода водопроводная остальное. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 30 мл на круговой качалке при 260 об/мин и температуре 28-30^оС в течение 48 ч. Титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости к концу ферментации 5,0 млрд. спор/мл. П р и м е р 2. Штамм В-3252 выращивают на поликомпонентной среде (ПКС) следующего состава, мас. кормовые дрожжи 2,8; кукурузная мука 1,4; гидрол 1,5; гидролизат хлопкового шрота 0,6; вода остальное. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 35 мл на круговой качалке при 200-220 об/мин и температуре 28-30^оС в течение 48 ч. Получают титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости 5,5 млрд. спор/мл. П р и м е р 3. Штамм В-3252 выращивают на обогащенной дрожжеполисахаридной среде следующего состава, мас. кормовые дрожжи (БВК) 3,6; кукурузная мука 2,86; соевая мука 0,5; мел 0,3; вода водопроводная остальное. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 30 мл на круговой качалке при 260 об/мин и температуре 28-30^оС в течение 48 ч. Титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости 7,9 млрд.спор/мл. П р и м е р 4. Для выращивания штамма используют среду, имеющую следующий состав, мас. кормовые дрожжи 2,8; кукурузная мука 1,4; зеленая патока 1,0; гидролизат хлопкового шрота 3,0; CaCl₂ 0,3; вода водопроводная остальное; рН среды до стерилизации 8,0. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 25 мл на круговой качалке со скоростью вращения 260 об/мин при 28-30^оС в течение 48 ч. Титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости 11,8х10⁹ млрд.спор/мл. В табл. 1 представлена сравнительная характеристика продуктивности известных продуцентов дендробациллина и предлагаемого штамма при их выращивании на различных производственных средах в лабораторных условиях. Приведенные в табл.1 данные свидетельствуют, что культура штамма В-3252 обладает большей продукцией спор на ДПС и обогащенной среде (на 20-25% по сравнению со штаммом ВНИИгенетика-79 и на 30% по сравнению со штаммом 49-8). По инсектицидной активности, определяемой в соответствии с ТУ 5,9.04.070.08-78 (Дендробациллин сухой), штамм В-3252 соответствует показателям производственных штаммов ВТ 49-8 и ВТ ВНИИгенетика-79 (ЛК₅₀ составляет в среднем 0,15%). Культура В-3252 при ферментациях на колбах не выделяла спонтанно-вирулентные фаги. По показателю фагоустойчивости штамм В-3252 соответствовал штамму ВНИИгенетика-79 и был лучше, чем штамм ВТ 49-8 (последний чувствителен к фагу Д3, см. табл.2). Были проведены производственные испытания штамма В-3252 в 6 операциях (3 на ПКС и 3 на обогащенной среде). Ферментации осуществляли в ферментерах емкостью 15 м³ в соответствии с регламентом производства дендробациллина (на ПКС). При выращивании штамма В-3252 на обогащенной среде ферментацию проводили при меньшем коэффициенте заполнения аппаратов и более интенсивном режиме аэрации. Результаты производственных испытаний представлены в табл.3. Из табл.3 следует, что по показателю съема готового продукта с одной операции (432 кг) штамм В-3252 превосходит штамм ВНИИгенетика-79 (403 кг). Использование штамма ВТ 220/707 позволило превысить показатели съема готового продукта, достигнутые к настоящему времени в производстве дендробациллина.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var dendrolimus В-3252 для производства дендробациллина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2