Способ получения ноурзеотрицина

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается ферментативного получения ноурзеотрицина - антибиотика , относящегося к группе стрептотрицинов. Цель изобретения - снижение расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика. Сущность способа сводится к тому, что штамм Str. noursei IMET JA3890 вьфащивают в полноценной питательной среде, содержащей стимулятор антибиотикообразования - азид натрия, бренцкатехин, амиталь, сульфат цинка или 6-аланин. При этом стимулятор можно вводить как до инокуляции питательной среды, так и в процессе культивирования до завершения экспоненциальной фазы роста продуцента. Процесс ферментации ведут в аэробных условиях при 25-30°С в течение 3-10 дней, а целевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости. 4 табл. с S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU ÄÄ 1390242

А1

ВСЕ(. 616 -, р ь q

13,", ц 11 ЛНОТЕКд

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (89) DD/161182 DDWPC 12 N/223321/

/14.08.80 (48) 02.05 ° 85 (21) 7773279/28-13 (22) 23.01 84 (46) 23.04.88. Бюл. М 15 (71) Йенафарм (И3) (72) Гаральд Бокер, Удо Грефе, Гейнц Трум, Гертрауд Брадлер, Гераль Шихт и Дитер Ноак (DD) (53) 615.779.93(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается ферментативного получения ноурзеотрицина — анти- биотика, относящегося к группе стрептотрицинов. Цель изобретения — сни(51)4 С 12 P 1 06//(С 12 P 1/06,С 12 R 1:57) жение расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика. Сущность способа сводится к тому, что штамм

Str. noursei IMET JA3890 выращивают в полноценной питательной среде, содержащей стимулятор антибиотикообразования — азид натрия, бренцкатехин, амиталь, сульфат цинка или

j5-алании. При этом стимулятор можно вводить как до инокуляции питательной среды, так и в процессе культивирования до завершения экспоненциальной фазы роста продуцента. Процесс ферментации ведут в аэробных условиях при 25-30 С в течение 3-10 дней, а целевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости. 4 табл.

1 390242

Изобретение относится к области биотехнологии и касается фермента,:тивного получения ноурзеотрицина— антибиотика, относящегося к группе стрептотрицинов.

Изолированный Брадлером и Трумом (1963-1965) из культуры варианта

Streptomyces noursei ATCC 11455 антибиотик — ноурзеотрицин in vitro акти- 10 ! вен против грамположительных и грам отрицательных бактерий, а также про;тив микробактерий, кроме того, прояв.ляет и противовирусное и тениацидальное действие. Ноурзеотрицин в отноше- 15 нии химической структуры представля.ет собой в основном смесь стрептотри;цина F u D (Грефе и др., 1974).

Штамм стрептомицетов, образующий антибиотик ноурзеотрицин, под назва- 20 нием Streptomyces noursei INET IA

3890 Ь, хранится в коллекции штаммов

Центрального института микробиологии и экспериментальной терапии АН. ГДР.

Согласно известным способам (Брад- 25 лер и Трум, 1963/1965; Бокер и Трум, 1966; Трефе и др., 1974) культивирование осуществляют в аэробных условиях. Для этого лиофилизированный на почве споровый материал этого штамма 30 стрептомицетов пересевают на подходящие агаровые среды. После 6-10-днево ного инкубирования при 28-30 С выросший таким образом спорулирующий мицелиальный газон используют для засева жидких стерильных питательных сред, состоящих из источников углерода и азота, а также неорганических солей.

В качестве источников углерода можно использовать различные сорта крах- 40 мальной муки растительного происхождения, например картофельный крахмал, глюкозу и/или глицерин. В качестве источников азота используют, в частности, соевую муку, различные амино- 45 кислоты и/или аммонийные соли, В начале ферментации кислотность среды, наиболее благоприятная для антибиотикообразования, находится в пределах рН 6,0-6,7.

Глубинное культивирование микроорганизма Streptomyces noursei IHET

IA 3890 Ь можно осуществлять в широкогорлых колбах или круглых плоскодонных колбах различного содержания на качалке, а также в аэрируемых стерильным воздухом ферментаторах с перемешивающим устройством из коррозионно-стойкого материала при 2530 С, преимущественно 26-28 С. Глубинное культивирование для получения вегетативного лосевого материала длится 24-72 ч, в частности 48 ч, а процесс выращивания главной культуры 72-144 ч, Выделение антибиотика из отделенного от мицелия фильтрата культуры осуществляется путем адсорбции к соответствующим катионообменникам, например Вофатит CP-300, и последующего элюирования разбавленными кислотами, (Брадлер и Трум, 1963; Грефе и др.

1977.

На известном питательном субстрате (Брадлер и Трум, 1985) штамм

Streptomyces noursei IMET ЕА 3890 Ъ образует лишь незначительные количества ноурзеотрицина (ниже 100 мкг/мл).

Добавлением аминоарилкарбоновых кислот, в частности 5-10 мИ о-аминобензойной кислоты, в начале выращивания культуры удается в известных технических условиях увеличивать выход ферментации в 5-10 раз (Бокер и Трум, 1966; Трум и Бокер, 1965; Грефе и др., 1974). о-Аминобензойная кислота и/или другие аминоарилкарбоновые кислоты (Грефе и др., 1974, 1977, 1978, 1979) вызывают специфическое подавление образования цитохрома а-типа (цитохромоксидаз), косвенно ингибируя тем самым как перенос аминокислоты из питательной среды в мицелий, так и окислительное дезаминирование аминокислот в клетках ноурзеотрицинообразователя. За счет этого предотвращается вторичный обмен в связи с клеточным изобилием азотных катаболитов и, кроме того, исключено, что аминокислоты, служащие в качестве предшественников ноурзеотрицина, в значительной степени потреблюются антибиотикообразователем в фазе его роста. Таким образом, эти аминокислоты лучше доступны для вторичного обмена в ходе образования ноурзеотрицина, поскольку для образования биомассы используются преимущественно неорганические источники азота (аммонийный аз от) .

Ферментативное производство ноурзеотрицина с использованием о-аминобензойной кислоты позволяет значительно увеличивать выход антибиотика.

Однако необходимое использование больших количеств аминоарилкарбоно1390242 вых кислот отрицательно влияет,на экономичность способа в связи с затратами на такие добавочные вещества.

Тепловую стерилизацию и соответственно химическую или радиационную стери5 лизацию растворов солей водных аминоакрилкарбоновых кислот нельзя осуществлять из-за разложения аминоарилкарбоновых кислот с образованием ток- .

10 сических продуктов превращения, для необходимого обеззараживания таких растворов остается только стерильная фильтрация. Последняя, однако, относительно трудоемка. Наличие аминоарилкарбоновЫх кислот в стоках хроматографических колонок затрудняет биологическую очистку сточных вод.

Цель изобретения — снижение расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика.

Способ осуществляется следующим образом.

Задача изобретения — создание способа, обеспечивающего промышленное 25 производство ноурзеотрицина без использования аминоарилкарбоновых кислот.

Добавки ингибиторов дыхательной цепи, например азид натрия или другие щелочные азиды, бренккатехин, а также амиталь (этилизоамилбарбитуровая кислота), и/или ингибиторов переноса аминокислот в живой клетке, например водорастворимые соли цинка или бета-алании, добавляемые в главную культуру в момент засева, оказывают аналогичное способствующее действие на биосинтез ноурзеотрицина, не меняя биологических свойств продукта ферментации. Необходимые для этого концентрации одного из этих веществ лежат в пределах 0,025 — 0,25 ммоль, в основном около О, 15 мм (азида натрия) или О,;5 — 1,75 ммоль, в основном 0,50, до 0,75 ммоль (сульфата цинка или /3-аланина) или 0,05

2,0 ммоль, в основном около 0,4, до 1,5 мм (бренцкатехина или амиталя) .

Для способа используют следующие ферментационные среды, содержащие,Е: среда Во-30 — глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,3; хлористый натрий 0,5; карбонат кальция 0,3; водопроводная вода для получения 100 мл, рН 6,5 (перед стерилизацией) среда

ВО-31 — кукурузный крахмал 3,0; глюкоза 0 3 соевая мука обезжиренная

0,7; нитрат аммония 0,5; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий 0,5; карбонат кальция 0,3; водопроводная вода для получения

100 мл, рН 6,0 (перед стерилизацией), среда Во-32 — картофельный крахмал

3,2; глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,4; нитрат аммония 0,7; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий О, 1; карбонат кальция 0 6 водопроводная вода для получения 100 мл, рН 6,0 (перед стерилизацией).

Эти среды, используемые для культуры продуцента, обеспечивают гораздо более высокий выход ноурзеотрицина по сравнению с известной ферментационной средой.

При наличии азида натрия и соответственно других щелочных азидов, бренцкатехина, амиталя, сульфата цинка и/или бетааланина, добавляемых в питательную среду отдельно или в смеси в момент засева культуры, ноурзеотрицинообразование увеличивается еще в 2-10 раз.

Ноурзеотрицин можно выделить из фильтрата культуры путем адсорбции с использованием активированного угля и катионообменников (сильно- и слабокислы). Предпочтительный способ основан на адсорбции на щелочной основе слабакислых катионообменных солей. Элюирование адсорбатов проводят водными или спиртовыми растворами минеральных кислот. Из минералокислых элюатов, получают чистую соль ноурзеотрицина.

Пример 1. Лиофилизированные на почве консервированные споры штамма Streptomyces noursei IMET IA 3890 b высевают на подходящую агаризованную среду, например среду Эмерсона.

Примерно после семидневного инкубио рования при 30 С вырезают из мицелиального газона участки размером 2 см2 и засевают ими культуральную среду

1-й стадии выращивания следующего состава, 7.: глюкоза 4,0; соевая мука обезжиренная 1 5у КН<РО Ор031 NaC1

0,5; СаСО 0,3; водопроводная вода

100 мл; рН 6,5-6,9 (перед стерилизацией).

Среду в количествах по 50 мл заливают в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 500 мп.

Стерилизацию осуществляют 35-минутным о нагреванием до 120 С в автоклаве.

1390242

Засеянные культуры инкубируют на качалке при 29 С в течение 48 ч. 3 мл посевного материала используют для засева ферментационной среды.

Для ферментации используют следующие питательные среды, %: среда

Во-30 — глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,3; NaC1 0,5; СаСО> водопроводная вода 100 мл; рН 1р

6,5 (перед сгерилизацией), среда ! Во-31 — кукурузный крахмал 3,0; .глюкоза 0,3; соевая мука обезжиренная

0э7; NHqИОз Оэ5; М8SOg 7H О 0 2

NaC1 0,5; СаСО 0,3; водопроводная вода 100 мл; рН 6,0 (перед стерилизацией) .

Ферментационные среды в количествах по 80 мл заливают в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы 20 емкостью 500 мл и стерилизуют при

120 С в течение 35 мин в автоклаве.

К предварительно подготовленной посевной культуре в момент засева прибавляют стерильно профильтрованные 25 водные нейтральные растворы соответствующих веществ (максимум 3,0 мл добавки/80 мл среды).

В табл, 1 и 2 приведены средние максимальные концентрации ноурзеотри- 30 цина, полученные в течение 72-100 ч инкубирования культуры продуцентом при 26 С методом диффузии в агар с использованием Bacillus subtilis

АТСС 6633 в качестве тест-микроорга35 низма.

Пример 2. Вегетативный посевной материал Str noursei выращивают, как описано в примере 1. По 10 мл

48-часовой культуральной жидкости используют для засева 2-й посевной среды. Эта среда имеет такой же состав, как и среда 1-й стадии, и ее стерилизуют таким же образом.

Среду в порциях по 400 мл заливают „ в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 2500 мл. Посео вы инкубируют при 29 С в течение 24 ч на качалке. По 800 мл получаемого таким образом посевного материала 2-й стадии выращивания используют для засева стерильных ферментационных сред, залитых в количествах по 20 л в заранее термостерилизированные стеклянные ферментаторы емкостью

30 л каждый. Для этого используют

55 указанные в примере I среды Во-30 и Во-31, которые дополнительно содержат еще 0,37. подсолнечного масла в качестве пеногасителя. Пепосредственно после засева добавляют стерильно профильтрованные водные нейтральные растворы приведенных в табл. 3 веществ (максимум 200 мл добавок/20 л среды) .

Ферментационные среды инкубируют в течение 120 ч при 26-28 С и коэффициенте аэрации 20 л воздуха/мин (при нормальном давлении) при перемешивании (440 об/мин). B качестве пеногасителя в случае необходимости используют стерильное подсолнечное масло.

Образуемый в процессе ферментации ноурзеотрицин ежедневно определяют микробиологическим способом, как описано в примере 1, Пример 3. Вегетативный посевной материал Str. noursei выращивают таким же образом и с использованием такой же питательной среды, как описано в примерах 1 и 2.

С помощью восьми полученных выращиванием на качалке 24-часовнях культур 2-й стадии засевают 150 л термостерилизованной среды (60 мин при 125 С) описанного состава, залитой в ферментатор из благородной стали (общая емкость 200 л), оснащенный устройствами для подачи стерильного воздуха и перемешивающим устройством.

Культивирование осуществляют при

26-28 0, скорости работы перемешивающего устройства 375 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 л культуральной жидкости/мин (при нори мальном давлении).

После 20-24 часового инкубирования используют 100 л этой культуры для засева 600 л ферментационной среды. Эта среда заранее простерилио зована 1-часовым нагреванием до 180 С (общая емкость 1000 л; имеются устройства для перемешивания, подачи стерильного воздуха и регулирования температурного режима).

Используемая для этого питательная среда Во-32 имеет следующий состав,Ж: картофельный крахмал 3 2; глюкоза

2,9; соевая мука обезжиренная 1,4; нитрат аммония 0,7; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий О, 1; карбонат кальция 0,6; подсолнечное масло 0,3 сульфат цинка кристаллический 0,048; водопроводная вода для получения 100 мл,.рН 5,66, 1 (перед стерилизацией).

1390242

Сульфат цинка добавляют в ферментационную среду перед стерилизацией.

Культивирование культуры осуществляют в течение 144 ч при 26-28 С, скорости работы перемешивающего уст5 ройства 290 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 л культуральной жидкости/мин (давление О, 140,16 M1Ia).

Для пеногашения используют по мере необходимости стерильное водосодержащее подсолнечное масло. Образуемый в процессе ферментации ноурзеотрицин ежедневно определяют микробиологическим способом как описано в примере 1.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Для выделения антибиотика 500 л культуральной жидкости с содержанием ноурзеотрицина 4000 мкг/л подкисляют щавелевой кислотой до значения рН

4,0 и сепарированием отделяют от твердых веществ. Затем фильтрат нейт- 25 рализуют 307.-ным водным раствором

Na0H и вновь сепарируют для отделения дополнительных продуктов флокуляции. Для адсорбции антибиотика нейтрализованный фильтрат культуры фильтруют со скоростью протекания 70 л/ч через колонну, заполненную 70 л Вофатита CP-300 (натриевая форма). Адсорбат промывают 50 л деионизированной воды, затем О, 1 н. уксусной кислотой до кислотности рН 5,5 протока и еще

15 л воды. Элюирование антибиотика осуществляют 50 л 1,0 н. НС1 и затем деионизированной водой, причем элюат принимают раздельно в двух фракциях:

40 фракцию I до перехода элюата в сторону кислых значений, а фракцию II в качестве кислого элюата.

Нейтральную фракцию .I (около 50 л) выпаривают до патоки непосредственно в вакууме при температуре максимум 40 С (около 4 л). Этот остаток растворяют в 60 л метанола. После фильтрации метанолового раствора при перемешивании порциями прибавляют всего 260 л ацетона, осаждают ноурзеотрицин-гидрохлорид. Осадок отфильтровывают, промывают 13 л смеси метанола:ацетона (1:3; V:Ч) и затем еще 8 л абсолютного ацетона и сушат в вакууме над концентрированной серной кислотой или пятиокисью фосфора.

Получают 740 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 950 ед/мг и

5,4/ сульфатной золы.

К солянокислой фракции II !5 л прибавляют порциями при перемешивании анионообменник Бофатит L-150 (ОН-форма) до нейтральной реакции раствора.

После отфильтровывания ионообменника фильтрат концентрируют и обрабатывают как и фракцию I, причем используемые качества растворителей соответственно уменьшены.

Получают 100 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 500 ед/мг и 10,07. сульфатной воды.

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма Streptomyces noursei INET IA 3890 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимулятор антибиотикообразования, в глубинных аэробных условиях при 25-30 С в течение 310 дней с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью снижения расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика, в качестве стимулятора антибиотикообразования используют 0,025-0,25 ммоль азида натрия, 0,05-2,0 ммоль бренцкатехина или амиталя, или О, 15-1,75 ммоль сульфата цинка или f5-аланина, при этом стимулятор вводят либо непосредственно в питательную среду до стерилизации, либо в процессе культивирования до завершения экспоненциальной фазы роста продуцента.

1390242

Таблица 1

Содержание ноурзеотрицина, мкгlмл, при добавке

Концентрация добавки, ммоль бренцкатехина амит аля азида натрия

183

230

29 I

330

458

308

544

372

0,175

230

469

210

165

263

224

277

560

329

221

311

702

228

294

258

552

291

396

1,00

439

255

301

412

1,25

437

212

206

362

1,50

250

1,75

124

157

174

473

5,0

500

610

10,0

Без добавок (контроль) 95

Примечание. СредаВо-30.

0,025

0,050

0,075

О, 100

0,125

О, 150

0,200

0,250

0,500

0,750 сульфата р-аланина о-аминобенцинка зойной кислоты

1390242

Таблица2

Содержание ноурзеотрицина мкг/мл, при добавке

Концентрация добавки, ммоль азида

1 натрия

| о-амино бензойной

HCJIOThl

961

1135

1426

1891

1085

657

949

1401

887

1711

1984

1166

1934

2158

986

868

2585

1,00

2604

713

1,25

2108

1,50

2,00

781

5 0

1934

1662

7,5

1612

10,0

Без добавки (контроль) 620

П р и м е ч а н и е. Среда Во-31.

Азид натрия 0,125 Бренцкатехин 0,500

Бренцкатехин 1,250

420

1835

169

396

0,050

О, 100

0,125

О, 150

О, 175

0,200

0,300

0,400

0,500

О, 750 бренц- ;сульфата

1 катехина цинка

1390242

14. Продолжение табл.3, Содержание ноурзеотрицина, мк г/мл

Концентрация добавки, ммоль

Среда Во-30 ) Среда Во-31

1860

445

Сульфат цинка 0,750

Без добавки (контроль) 790

Таблица4

Концентрация добавки

Сульфат цинка

0,048%

4876 5020

990 2377

210

760

850

865

200

530

Редактор Н.Гунько Техред М..Ходанич Корректор Г.Решетник

Заказ 1736/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035 ° Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Без добавки (контроль)

iодержание ноурзеотрицина, мкг/мл, при продолжительности культивирования, ч

4 48 72 96 120 144