Способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине

 

Предлагаемый способ относится к йеяьскохоэяйственной микробиологии и Может быть использован для оценки качества бактериального удобрения ризоторфина. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Способ заключается в следующем. Суспензию риэоторфима в 1%-ном поливи-, ниловом спирте фильтруют, центрифугируют , осадок клеток ресуспендируют в буферном растворе и инкубируют с :. субстратом 4-иитрофенил -1)-глюкопиранозидом, гидролизующимся ферментом -глюкозидазой в присутствии толуола, в течение 2 ч при З7 с, окрашенные образцы фотометрирукот при 430-440 нм на спектрофотометре и полученные значения оптической плотности сравнивают со значением оптической, плотности для суспензионных культур клубеньковых бактерий с известным титром жизнеспособных клеток. 1 табл. (Л

„„SU„„3430518 А 1

СОЮЗ СОВЕТСИИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)S С 12 И 1/00, С 12 Q 1/00, С 04 F 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

° Л

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРМТИЙ (46) 30.08.91 Бюл. Ф 32 (21) 4086850/13 (22) 04.07 86 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) В.В. Симаров, А.A. Аронатам и С.З. Резник (53) 576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 935529, кл. С 12 и 1/00. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

ЖИ 1НЕСПОСОВПЦХ КЛЕТОК 1ИУВЕНЬКОВИХ.

БАКТЕРИЯ В РИЭОТОРФИНЕ (57) Предлагаемый способ относится к седьскохоэяйственной микробиологии и йоает быть использован для оценки качества бактериального удобрения риэоторфина. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.

Способ заключается в следующем. Gycпензию риэоторфииа в fX-ном поливи-, ниловом спирте фильтруют, центрифу" гируют, осадок клеток ресуспендируют в буферном растворе и инкубируют с:, субстратом 4-нитрофенил-ф-1)-глюкопиранозидом, гидролизующимся ферментом Р-глюкозидаэой в присутствии толуола, s течение 2 ч при 37 С, окраюенные образцы фотометрируют при

430-440 нм на. спектрофотометре и полученные значения оптической плотности сравнивают со значением оптической, плотности для суспензионных культур клубеньковых бактерий с известным титром хизнеспособных клеток. 1 табл.

1410518

Для определения количества жизнеспособных клеток в бактериальном препарате ризоторфине необходимо отделить клетки бактерий от частиц наполнителя — 1 орфа, что достигается приготовлением суспензии риэоторфнна на 1%-ном растворе поливинилового спирта, являющегося поверхностно-активным веществом, при помощи которого достигается иммобилизация бактериальных клеток со 100%-ным сохранением их жизнеспособности и активности ферментов, в том числе и -глюкоэидазы.

Пример 1, К 1 г бактериального препарата рнзоторфина для люцерны вводят 10 мл 1%-ного. раствора поливинилового спирта на дистиллированной воде и встряхивают на качалке при 180 об/мин в течение 30 мин при 28 С. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр на воронке Бюхнера с водоструйным насосом. Фильтрат разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 2,5 мл О, 1 N ацетатного буфера (рН 6,5), добавляют 10 мкл толуола, встряхивают при 180 об/мнн о в течение 20 мин при 28 С добавляют

О, 1 мл субстрата 4-нитрофенил-P-Dглюкопиранозида в 0,1 М ацетатном бу" фера (pH 6,5 при концентрации субстрата 10 мг/мл}, инкубируют 2 ч при

37 С.

Фотометрирование проводят на спектрофотометре при 440 нм или на фото.электрокалориметре (зеленый светоФильтр). Значение Е4о . равно 0,30, что соответствует количеству жизнеспособных клеток 4,5 10 в 1 r.

При посеве препарата на питательную среду (контроль известным методом) титр клеток равен 4,7 ° 10 в 1.r,. Та9 . ким образом, способ позволяет получить вполне достаточную точность при эначитеАьном выигрьппе времени (3,5 ч вместо 5 сут.).

П р и и е р 2.. Опыт ставился точ ио так же, .ио бьясь использован риэоторфин для люцерны, хранившийся в течение 3 мес. Предлагаемый способ показал значение 0,9 109 клеток в 1 г, обычным способом было получено зна- чение 1,0 10 клеток.

Пример 3. Опыт ставился точно так же, но был взят риэоторфин .для гороха. Предлагаемый способ по6 ° 107

1,2 50

S 10

0,20

0,04

3 ° 10

1,2 10.

4: ° 10

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологни и может быть использо ено для оценки качества в производстве бактериального удобрения ризоторфина.

Цель изобретения — ускорение и упрощение способа.

Способ заключается в следующем. . Суспензию ризоторфина в 1%-ном 10 поливиниловом спирте фильтруют через бумажный фильтр, центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют в буферном ..растворе и инкубируют с субстратом

4-нитрофенил-11-D-глюкопиранозидом, гидролизующимся ферментом Я -глюкозидазой, в присутствии толуола в течение 2 ч при 37 С. Окрашенные образцы Фотометрируют при 430-440 нм на спектрометре (фотоэлектрокалори- 20 метре) и нолученные значения оптической плотности сравнивают со значе нием оптической плотности для суспенэионных культур клубеньковых бактерий с известным титром жизнеспособных 25 г клеток.

Таким образом, сущность изобретения заключается в определении коли- . чества жизнеспособных клеток клубень. ковых бактерий по их Р --гликоэидаэ- 30 ной активности, которая служит пока-зателем их жизнеспособности.

В таблице приведены данные по опре.делению активности Я -глюкозидазы .в суспенэиойных культупах клубеньковых бактерий люцерны при Прогревании бактериальной суспенэии прн 45 С в течение различных промежутков времени.

Укаэанные культуры, таким образом, содержат .различные количества жизне- 0 способных клубеньковых бактерий, чему соответствуют разные величины Р -глю козидазньй активности, Составитель T.Полянская

Техред- Л. Сердюкова .

Корректор, М,Пожо

Редактор С.Рекова

Тираж 366 ВНИИНК Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Москва 3-35, Рауеская наб., д. 4/5

Заказ 3443

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1410518 4 .

Ф казал значение 7,2 ° 10Э клеток, иэ » от наполнителя, приготовление сусвестным способом было получено зна- пензии бактерий добавление субстра° 9

1 чение 7,4 10 . та, инкубирование полученной смеси с последующей оцСнкой результатов, Таким образом, предлагаемый спо- отличающийся тем, что, с соб позволяет производить экс Р-. целью ускорении и Упрощения способа, оценку качества препарата риэоторфн- отделение клеток бактерий от,наполна по содержанию в нем жизнеспособных нителя осуществляют раствором поликлеток клубеньковых бактерий беэ при- 0 винилового спирта, перед введением менения какю -либо дефицитных и доро- субстрата в суспенэию бактерий ввогих приборов. Способ может быть так» дят толуол, в качестве субстрата исже использован для анализа культу- пользуют 4-нитрофенил-Я-Ь-глюкопиранаральных яядкостей, t.е. для контроля . знд, после инкубирования смеси опре» процесса ферментации. 1$ деляюу. оптическую плотность гидро" лизата, полученного в процессе инку»

Ф î р и у л а и s о б Р e w e a и я бирования смеси, путем фотометрнрования при 430-440 нм, а оценку реэуль.Дпособ о количества татов осуществляют путем сравнения ое жизнеспособных клеток клубеньковых 20 тической плотности гидролизата с эта-,. бактерий в ризоторфине, цредусматри дойными суспензиями бактерий, содер" вающий приготовление сусцензии Ризо" жащих известное количество жизнеспоторфина, отделение клеток бактерий собных бактерий.