Ингибитор репарации двунитевых разрывов днк

 

Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно к исследованиям генетически активных химических соединений, и может быть использовано при изучении характера действия ряда мутагенных факторов окружающей среды, а также в онкологии для усиления действия ионизирующего излучения при радиотерапии опухолей. Основу изобретения составляет выявленное авторами новое свойство.кислых (/-полипептидов (полиглутама та и полиаспартилглутамата), ранее использовавшихся в качестве ингибиторов репарации однонитевых разрывов ДНК, полностью подавлять восстановление двунитевых разрывов, которые возникаг ют в ДНК под действием облучения. Вывод о полном (в пределах ошибки измерения ) подавлении:процесса репарации ДР в период контакта клеток (Hela и фибробластов китайского хомячка) с ингибиторами (как в ходе облучения, так и после его завершения) может быть сделан на основании данных: а) о равенстве степени деградации ДНК в опытных образцах и контроле, где восстановление ДР нацело блокировано охлаждением до 4°С сразу после окончания облучения; б) о сохранении в присутствии ПГ и ПАГ достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК, после завершения обработки г.-лучами; в) о незначительном уровне (менее 3% от1 онтроля) включения Н-тимидина клетками в период их контакта с ингибито - рами. Предложенные ингибиторы сами по cefie не вызывают образование ДР в ДНК и практически не влияют на жизнеспособность клеток; действие обоих ингибиторов обратимо. Максимальный эффект достигается при концентрациях ПГ и ПАГ соответственно 20 и 100 мкм (против 400 мкм для прототипа - -арабйнофуранозиладенина); время, необходимое для достижения максимального эффекта 10-15 мин (против 30-60 мин для прототипа). В отличие от известных ингибиторов восстановления ДР ПГ и ПАГ не обнаруживают токсического действия по отношению к клеткам, находящимся в S-фазе, и, следовательно работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу. 1 табл. (Л 00 со 00 fC

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (511 4 С 12 И 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4123712/31-13 (22) 26.09.86 (46) 23.08.88. Бюл. № 31 (71) Институт биофизики АН СССР (72) А.И. Медведев (53) 577.391 (088.8) (56) Bryant P.Е., Blucher D. The Effects of 9-В-arabinofuranosyladenine

on the Repair of DNA strandbreaks in

Х-irradiated Ehrlich Ascites Tumor

Се11s. Int.I.Radiat. Biol., 1982, 42, № 4, р. 385-394. (54) ИНГИБИТОР РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ

РАЗРЫВОВ ДНК (57) Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно к исследованиям генетически активных химических соединений, и может быть использовано при изучении характера действия ряда мутагенных факторов окружающей среды, а также в онкологии для усиления действия ионизируюшего излучения при радиотерапии опухолей.

Основу изобретения составляет выявленное авторами новое свойство.кислых Ы-полипептидов (полиглутамата и полиаспартилГлутамата), ранее использовавшихся в качестве ингибиторов репарации однонитевых разрывов ДНК, полностью подавлять восстановление двунитевых разрывбв, которые возника р ют в ДНК под действием т-облучения.

Вывод о полном (в пределах ошибки измерения) подавлении процесса репара„„SU,, 1418339 А1 ции ДР в период контакта клеток (Hela и фибробластов китайского хомячка) с ингибиторами (как в ходе облучения, так и после его завершения) может быть сделан на основании данных: а) о равенстве степени деградации ДНК в опытных образцах и контроле, где восстановление ДР нацело блокировано охлаждением до 4 С сразу после окончания облучения; б) о сохранении в присутствии ПГ и ПАГ достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК, после завершения обработки .-лучами; в) о незначительном уровне (менее 37. отконтроля) включения Н-тимидина клетками в период их контакта с ингибито® рами. Предложенные ингибиторы сами по себе не вызывают образование ДР в ДНК и практически не влияют на вивнеспособность «петок; действие обоих ингибиторов обратимо. Максимальный эффект достигается при концентрациях 2

ПГ и ПАГ соответственно 20 и 100 мкм (против 400 мкм для прототипа - 9-ф-арабинофуранозиладенина); время, необходимое для достижения максимального эффекта IO-15 мин (против 30-60 мин для прототипа). В отличие от известных ингибиторов восстановления ДР

ПГ и ПАГ не. обнаруживают токсического Ж действия по отношению к клеткам, на ходящимся в S-фазе, и, следовательно .работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу. 1 табл.

Г йв

1418339

Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно к изучению генетически активных химических соединений, и может быть использовано при исследовании характера повреждаюцих воздействий ряда мутагениых факторов окружающей среды, а также к онкологии для усиления действия ионизирующего излучения при радиотерапии опухолей.

Основу изобретения составляет выявленное новое свойство кислых о -полипептидов (полиглутамата и полиаспартилглутамата), которые ранее использовались для подавления репарации однонитевых разрывов ДНХ, полностью ингибировать восстановление двунитевых разрывов (ДР), возникающих в ДНК под действием -облучения. 20

В качестве модельной системы при исследовании эффекта полиглутамата (ПГ) и полиаспартилглутамата (ПАГ) используют находящиеся в логарифмической фазе роста несинхронизирозанные культуры клеток Не1а и фибробластов китайского хомячка, которые подвергают воздействию -облучения (в дозе 50-100 Гр) в присутствии ингибиторов. 30

Вывод о полном (в пределах ошибки измерения) подавлении процесса вос." становления ДР в период контакта ин / гибиторов с клетками (как в ходе об" лучения, так и после его окончания) делается на основании данных о примерном равенстве степеней деградации

ДНК в опытных образцах и контроле,, где репарация заблокирована охлаждением до 4 С, а также на основании данных о сохранении в присутствии ПАГ и ПГ, достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК в течение длительного времени (1 ч). При этом принимается во внимание, что з 1 период контакта ингибиторов с клетками уровень включения Н-тимидина составил не более 37. от контрольного.

Присутствие в среде инкубации ПГ и ПАГ (в концентрациях, достаточных для полного подавления репарации) са-мо по себе не вызывает образования

ДР и практически не сказывается на жизнеспособности клеток. Действие обоих ингибиторов носит обратимый характер.

Полное ингибирование процесса восстановления ДР под действием НГ и ПАГ наблюдается при концентрациях, з несколько раз меньших, чем з известном иигибитаре (20 мкМ пля ПГ и 100 мкМ для ПАГ против 400 мкМ в случае 9-р-арабииофураиозиладеиииа); время обработки клеток предлагаемыми ипгибиторами, необходимое для получения максимального эффекта, з 2-4 раза меньше, чем при использовании известного иигибитора (10-15 мии против 3060 мин) .

Кроме того, ПГ и ПАГ не проявляют избирательной токсичности по отношению к клеткам, находящимся з Б-фазе клеточного цикла, и, следовательно, работа с ними Be требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу роста.

Пример 1. Ингибирование репарации дзунитевых разрывов ДНК в клетках Hela, облученных в дозе 100 Гр, полиаспартилглутаматом. Испольэовали несинхронизоваиную, находящуюся в логарифмической стадии роста, монослойную культуру дзуднезиых клеток

Не1а, которые культивировали на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Сразу после посева клеток з среду вводили Н-тимидин (0,5 мкмК/мл), за 16 ч до начала эксперимента среду с меченым тимидином слизали, клетки промывали средой 199 и инкубирозали в среде с сывороткой. В эксперименте использовали два образца клеток.

Первый образец. Клетки„ облучаемые при 37 С в присутствии ингибитора восстановления, промывали физраствором рН 5,0, добавляли полиаспартилглутамат (Ы-поли†DL-аспартилглутамат, статистический полипептид с мол.мас, 1,5-3,5 тыс. дальтон) з концентрации

10 мкМ з физрастворе с рН 5,0.

Через 10 мин после добавления ингибитора клетки облучали в дозе 100 Гр при мощности дозы 3,3 Гр/мин и через

10 мин после окончания облучения в части клеток определяли степень дЕградации ДНК. Другую часть клеток отмы вали средой 199 от ингибитора и культивировали на среде с сывороткой при 37ОC з течение 4 ч. Через 1, 2, 3 и 4 ч определяли степень деградации

ДНК.

Второй образец. Клетки, облучаемые при 4 С, промывали физраствором с рН

5,0 и температурой 4 С, облучали в физрастворе з той же дозе при 4 С и через 10 мин после окончания облуче"

141833 г

Условия обработки клеток

Уровень

Уровень включения через

2 ч после отвключения после обмывки клеток от ингибиторов луч ения в присутс твии ингибиторов ния в части клеток определяли степень деградации ДНК. Другую часть клеток отмывали средой 199 и культивировали на среде с сывороткой при

37 С в течение 4 ч. Через 1, 2, 3 и

4 ч определяли степень деградации ДНКСтепень деградации ДНК во всех случаях измеряли методом элюцип с мембранных фильтров в неденатурирующих условиях с последующим определением радиоактивности в толуольно-тритоновом ецинтилляторе.

ДНК, оставшаяся на фильтре, сбставляет, 7.: для клеток, облученных в при-1Б. сутствии полиаспартилглутамата, при фиксации сразу после облучения 17,2

+5,6, зафиксированных через 1, 2, 3 и 4 ч репарации 45,923,0; 50,4+4,2;

54, 1+4, 2; 65,0 3, 0 соответственно; для клеток, облученных при 4 С и зафиксированных сразу после облучения

21,5+3,0, зафиксированных через 1, 2, 3, 4 ч репарации соответственно

64, 427, 8; 7?, 8 3, 8; 84, 1 1, 9 .и 86,0f

15,6.

Пример 2. Ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК в фибробластах китайского хомячка клона 431, облу е н в дозе 100 I p, полигута- 30 концентрапиях, Затем вводили тимидин, облучали клетки (в дозе 70 Гр) и определяли уровень включения метки.

Часть образцов отмывали от ингибиторов, затем продолжали инкубировать на среде с сывороткой Н-тимидином в те-, чение 2 ч.

В таблице приведены результаты измерений. За 1007. принималось включе-. ние в клетки, инкубируемые беэ ингибиторов и соответствовало 20718 + 5510 имп/мин/мпн.клеток. Число опытов, из которых представлены ниже средние значения, составило 3-4. В таблице приведен уровень включения для нерастворимой в ТХУ фракции (уровень включения кислоторастворимой фракции меченого тимидина близок для всех вариантов опыта). матом.

Методика выращивания клеток, обработки ингибитором восстановления, облучения, отмывки и репарации разрывов, определения степени деградации ДНК аналогична описанной в примере 1.

При этом концентрация полиглутамата (o(-поли-с(-глутаминовая .кислота с мол.мас. 2-15 тыс. дальтон) составляла

20 мкМ/л.

ДНК, оставшаяся на фильтре, составляет, X: для клеток, облученных в присутствии ингибитора и зафиксированных сразу после облучения, 21, 1+7,4, .зафиксированных после отмывки от поли4б глутамата и репарации в течение 1, 2, З.ч 52,9 5, 1; 67,2+4,0, 57,2 4,? соответственно, для клеток, облученных при 4 С и зафикспрованных сразу о после облучения, 24,0 5,5, зафиксированных через 1, 2, 3 ч репарации соответственно 81,5 0,2; 76,9+2,8 и

79,7+1, 7.

Пример 3. Использовали клетки китайского хомячка клона 431. Перед введением ll-тимидина клетки инкубировали в течение 15 мин с ингибиторами в указанных в примерах 1 и 2

Без ингибитора

578, 5 187, 6

100

Ингибитор

НАГ

1,4+0,6

62,1й19,4

Ингибитор

ПГ

2,9 1,5

83,2+18,5

Формула изобретения

Применение /-поли-L-аспартилглутамата с мол.мас. 1,5-3, 5 КД или 2 -поли-L-глутаминовой кислоты с мол.мас.

2,0-1,5 КД в качестве ингибитора репарации двунитевых разрывов ДНК.

Из приведенных примеров ясно, что полиглутамат (мол.мас. 2-15 тыс. дальтон) и полиаспартилглутамат (мол.мас.

1,5-3,5 тыс. дальтон) в соответствующих концентрациях обеспечивают полное ингибирование процесса репарации

ДР и обладают большей относительной эффективностью и меньшей токсичностью.