Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ

 

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам 2,0-2,6 мг/мг лиганда. Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего ковалентного связывания ее со специфическим лигандом фрагментов oL -цепи молекулы коллагена или об 1СВ7-бромцианового пептида коллагена в качестве лигандов. 1 табл. а «е (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 В 01 J 20 26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ М

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4143143/31-05 (22) 29.09.86 (46) 30.08.88. Бюл. 11 - 32 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР, Московский институт тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова и Харьковское предприятие по производству бактерийных препаратов (72) Б.А.Клящицкий, В.Х.Митина, Н.А.Французова, Н.И.Соловьева, Т.И.Езикян, Ю.М.Краснопольский, Г.А.Сенников, В.И.Швец и В,Н.Орехович (53) 661.183.1(088.8) (56) Туркова Я. Аффинная хроматография. М.: Мир, 1970, с. 319.

Engvall Е., Ruoslahti Е. Binding

of soluble form of fibroblast surface

protein, fibroneetin, to collagen.

"Int. J. Cancer" ° 1977. ч, 20, р. 1-5.

„.80„„419717 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА И КОЛЛАГЕНАЗ (57) Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам

2,0-2,6 мг/мг лиганда. Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего ковалентного связывания ее со специфическим лигандом фрагментов оС,-цепи молекулы коллагена или ñ6 1СВ7-бромцианового пептида коллагена в качестве лигандов. 1 табл.

1419717

Изобретение относится к химии полимерон, а именно к способу получения биоспецифических адсорбентон для выделения фибронектина и коллагеназ, и может быть использовано в биохимии и медицине.

Целью изобретения является повышение емкости адсорбентон по фибронектину и коллагеназам. 10

В качестве специфических лигандов в способе используются о -цепи коллагена или о 1СВ7 пептид, получаемый

Ф бромцианоным щеплением о 1 -цепи коллагена. 15

Пример 1. 140 мг лиофилизованного коллагена из кожи крыс растворяют в 70 мл 0,5 M уксусной кислоты о в течение 16 ч при 4 С, Раствор диализуют против 8 л 0,06 М натрий-аце- 20 татного буфера, рН 4,8, за 16 ч при

4 С и затем нагревают при 45 С н течение 30 мин. Полученный раствор фильтруют, вводят на колонку с целлюлозной КМ-52 (2,5х25 см), уравнове25 шенной 0,06 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,8 и элюируют линейным градиентом NaC1 (О -" 0,1 Г1) в том же буфере. Смеситель для градиента двухкамерный, по 400 мл в каждой камере, 30 общий объем — 800 мл. Хроматографию о проводят при 42 С, Скорость тока

200 мл/ч. Фракции анализируют по поглощению при 230 нм. Соответствующие фракции, содержащие К, М, +

+ /5„, (, и Ы. -компоненты, диализуют против 0>1 И уксусной кислотой и лиофилизуют. Суммарный ныход по белку 50>21 (о, цепь — 9,52 мг, Ы вЂ”

18,4 мг, p „ — 7,76 мг, p>< — 22,5 мг, 40 о, + j5 12,09 мг). лиофилизованные Ы, — или /3н фрагменты (по 180 мг) растворяют в

40 мл 70Х. меравьиной кислоты и инкуо бируют 4 ч при 37 С под азотом с 45

0,5 г BrCN. Затем смесь вводят на колонку с сефадексом С-25 (1,8 х х 60 см), уравновешенным О, М уксусной кислотой. Скорость тока 45 мл/ч.

Фракцию, выходящую с исключающим объемом колонки, лиофилизуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов о, -цепи коллагена. Получено

7,5 мг о 1 СВ7-пептида коллагена.

Лиофилизованный о 1СВ7-пелтид коллагена (20 мг) растворяют н 10 мл

0,1 М Г1аНСС, рН 8,4, содержащего

0,15 M NaC1, добавляют 10 мл бромциан-актинированн эй сефарозы 4В и суспензию перемешивают н течение о

16 ч при 4 С. Затем сорбент промывают 50 мл того же буфера, 50 мл о воды и перемешинают 2 ч при 20 С с.

10 мл 1 Г1 растнора этаноламина, оттитронанного 6 н ° НС1 до рН 9. Сорбент отделяют и промывают по 50 мл

0,1 M натрий-ацетатного буфера с 1 М

NaC1> рН 4,5 и 0,1 M натрий-боратного буфера с 1 M NaC1, рН 9,0 (операцию повторяют трижды). Затем сорбент промывают водой и хранят о, в виде суспензии н воде при 4 С в присутствии 0>02Х. азида натрия.

Количество присоединенного Û,1ÑÂ7пептида определяют по содержанию оксипролина в гидролизате аликноты адсорбента.

Пример ы 2-9. Аналогично получают адсорбенты на основе сефарозы 4В или CL-4B, сферона 1000 и тойопала HW-65 с о, — и о -цепями, />» — и P>q -компонентами,о 1СВ8бромциановым пептидом и желатином.

Свойства полученных сорбентов представлены в таблице.

Пример 10. К 6 г силикагеля

MCA-750 добавляют 35 мл толуола и

2,5 мл 3-(2,3-эпоксипропокси)пропилтриметоксисилана, вакуумируют на роторном испарителе 5 мин и кипятят о при перемешивании 10 ч при 110 С.

Сорбент промывают на фильтре 70 мл толуола, 140 мл ацетона и высушивают.

К полученному продукту добавляют

167 мл 0,1 н.НС1 н ацетоне и перемешивают 2 ч при 20 С. Сорбент промывают 100 мл воды до рН 7 промывных о вод и сушат в вакууме лри 80 С.

Полученный сорбент суспендируют в растворе 0,256 г периодата натрия в 200 мл воды и перемешивают в течео ние 1 ч при 20 С, Затем сорбент промывают 300 мл воды и перемешивают в

0 течение 16 ч при 20 С с раствором

100 мг оС -цепи н 50 мл воды, после чего продукт промывают 100 мл воды, суспендируют в 50 мл 0,1 M бикарбонатного буфера, рН 8,5, добавляют

0 05 r бромгидрида натрия и перемео шивают в течение 1 ч при 20 С. Полученный адсорбент промывают 50 мл

0,1 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,5, содержащего 1 M NaC1., и 50 мл

0,1 М натрий-боратного буфера, рН 9,0, содержащего 1 Г1 Г1аС1 (операцию повторяют трижды) . Затем сорбент о промывают водой и хранят при 4 С. з 14197

Свойства адсорбента приведены в таблице.

Пример 11. (Хроматография фибронектина плазмы крови человека

5 на адсорбентах, содержащих фрагменты молекулы коллагена), Инкубируют 1 ч при 20 С раствор плазмы крови человека (лиофилизованную плазму из 60 мл крови растворяют 10 в 30 мл 0,05 М трис-буфера, рН 7,4, с О, 15 М NaC1, 0,5 мМ PMSF и 0,02% азида натрия) с 10 мл oL -сефарозы 4В. Затем адсорбент упаковывают в силиконизированную стеклянную ко- 15 лонку, которую промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм в элюате. После этого колонку промывают уравновешивающим буферным раствором, содержащим 20

1 M мочевину (50 мл), и вымывают фибронектин тем же буфером с 4 М мочевиной (14 мл), В заключение колонку промывают тем же буфером с 8 M мочевиной. Функции анализируют по погло- 25 щению при 280 нм. Фракции, содержащие фибронектин, диализуют против 0,1 М уксусной кислоты и лиофилизуют. Выход фибронектина 17 мг (94,4%). Чистота полученного препарата подтверждена . 30 данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Пример 12. (Хроматография коллагенаэы из культуральной среды фибробластов кожи человека на

<1СВ7-сефарозе).

А. Коллагеназу выделяют из 5 л среды осаждением сульфатом аммония (60% насыщения)), В случае бессыворо- 40 точной среды осаждение проводят в присутствии сывороточного альбумина в концентрации 0,5% ° Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в

0,01 M трис-НС1 буфере, рН 7,5, со- 45 держанием 0,001 M CaC1, и после диализа против этого же буфера раствор, содержащий 300 мг белка, вводят на колонку с KM-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Элюцию кол- 5р лагеназы проводят градиентом NaC1 (Π— 0,3 M) в 0,01 М трис-НС1 буфере, рН 7,5, с 0,001 М СаС1 со ско— ростью тока 0,1 мл/мин. Степень очистки на стадии ионообменной хроматографии — 30 раз. Полученный препарат коллагеназы используют далее для аффинной хроматографии. Коллагеназную активность определяют по гидролизу (C)-коллагена.

Б. Сорбент < 1СВ7-сефароза (5 мл упакованного объема) инкубируют 1 ч о при 4 С с раствором 10 мг препарата коллагеназы, полученной в п.А, в

10 мл 0,05 M трис-НС1 буфера, рН 7,4, содержащего 0,1 M NaC1, 0,001 М

CaC1, 0,005 M PMSF и 0,05% Brij 35.

Затем сорбент упаковывают в колонку (1,2 х 4 см), которую промывают при

4 С по 25 мл буфера А, буфера А с 1 М

NaC1, 0,05 M натрий-ацетатного буфера, рН 5,2, содержащего 0,2 M NaC1

0,00 1 СаС1, 0,005 М PMSF и 0,05%

Brij 35. Хроматографию проводят при скорости тока 20 мл/ч, объем фракций — 1 мл. Фракции анализируют по поглощению при 280 нм и по коллагеназной активности. Коллагенолитическая активность распределялась в двух фракциях, элюированных буфером А, содержащим 1 11 NaC1 и натрий-ацетатным буфером, Выход по активности 40%, степень очистки 10 раз.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимого носителяи последующего ковалентного связывания его со специфическим лигандом, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повьппения емкости адсорбентов по фибронектину и коллагеназам, в качестве специфического лиганда используют о -цепи молекулы коллагена иои ос 1СВ7-бромциановый пептид коллагена.

1419717

Свойства адсорбентов с иммобилиэованными фрагментами молекулы коллагена

Содержание иммобилизо

Емкость по фибронектину

Адсорбент

Пример, У ванного ли ганда, мг/ геля моль/моль иммобилимг-мг иммобилнэованного эованного лиганда лиганда оС -СВ7-сефароэ а-4В р -сефароэа 4В -сефароэа С -4В о .-сефароэа 4В

Р -сефароза 4В

Р -сефароза 4В

0,6

2,5

0,14

0,6

2,5

0,57

0,7

2,25

0,51

0,45

1,4

2,0

5 (контроль)

6 (контроль) 1,7

1 927

0,58

1,4

0 5

7(контроль) Ы 1СВ8-сефароэа 4В

0,86

0,13

0,0074

oL -сферон 1000

g.1СВ7-тойопал Н-60

0,8

2,6

0,59

0 5

2,25

0,13

Ф

Ы. -макропористый силикагель 3 5

2,6

0,59

Желатин-сефароэа 4В 0,6 (сравнительный по прототипу) 1,3

Ф

В мг/г сухого веса матрицы

Составитель Л. Чупова

Техред Л.Олийнык Корректор, А, Тяско

Редактор М. Бандура

Тираж 519 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4266/10

Производственно-полиграфическое предприятие, г. УжгорОд, ул. Проектная, 4