Способ количественного определения в зерне и зерновых продуктах 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12,13- эпокситрихотецена-3-ол

 

И зобретение относится к микробиологии , а именно к микробиологическим исследованиям токсинов. Целью изобретения является повьппение чувствительности способа определения 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотецена-З-ол путем снижения предела обнаружения минимальных количеств микоток ина. Изобретение позволяет повысить чувствительность определения 4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотецена-3-ол (микотоксина Т-2) микробиологическим методом. Применяют для обнаружения пятен микотоксина на хроматографической пластинке специфическую чувствительн ао культуру дрожжей Saccharomyces lactis BKMY- .459, параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его 0,015-0,1 мкг, используют для заливки хроматографических пластинок после хроматографии сусло-агар с внесенным в него стандартнаированньм количеством дрожжевых клеток 0,8-1 10 в мл., определяют количество токсина Т-2 в исследуемом образце по наименьшему количеству стандарта токсина и иследуемого образца, при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжей с Rf образца , равным Rf чистого шшотоксина. W

СОЮЗ СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И QTHPHTHflM

llPM ГКНТ СССР (21) 4185853/28-13 (22) 09.12.86 (46) 15.08.89. Бюл. № 30 (71) Институт питания АМН СССР (72) И.Б.Куваева, Э.В.Болтянская и Е.$. Кроякова (53) 544.(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 660653, "кл. А 23 К 1/00, 1979.

t (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОВЫХ ПРОДУКТАХ

4, 15-ДИАЦЕТОКСИ-8- (3-МЕТИЛБУТИРИЛОКСИ) -1 2, 13-ЭПОКСИТРИХОТЕЦЕ НА-3-ОЛ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к микробиологичесKHM исследованиям токсинов. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения

4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12, 13-эпокситрихотецена-3-ол путем сниженмя предела обнаружения минимальных количеств микотоксина.

Изобретение позволяет повысить чувстИзобретение относится к микробиологии, а именно к микробиологическим исследованиям токсинов.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа определения

4,15-диацетокси-8-(3-.метилбутирилокси)-12, 13-эпоксит рихотецена-3-ол путем. снижения предела обнаружения минимальных количеств микотоксина.

Способ заключается в экстракции образца, нанесении экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующей ее хроматогра„,SU» 14244 4 А1

2 вительность определения 4, 15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси) — 12, 13-эпокситрихотецена-3-ол (микотоксина Т-2) микробиологическим методом. Применяют для обнаружения пятен микотоксина на хроматографической пластинке специфическую чувствительную культуру дрожжей Saccharomyces lactis ВКИ7459, параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его О, 015-0, 1 мкг, используют для заливки хроматографических пластинок после хроматографии сусло-агар с внесенным в него стандартизированньи количеством дрожжевых клеток 0,8-1»

"9

« 10 в мл., определяют количество токсина Т-2 в исследуемом образце по наименьшему количеству стандарта ток- С сина и иследуемого образца, при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжей с Rf образца, равным Rf чистого микотоксина. фии, обнаружении токсина с помощью специфической культуры дрожжей. Параллельно с хроматографией образца

-хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием токсина в пятне О, 015; О, 02; О, 03; О, 04; О, 05ю

0,07; О, 1 мкг. Обе пластинки заливают агаризованной средой с внесенным в нее стандартизированным количеством

0,8-1 ° 10 в 1 мл дрожжевых клеток

5 штамма Saccharomyces lactiя ВКМ7-459, инкубнруют пластинки, определяют наи3 142449 меньшее количество исследуемого образца и наименьшее количество стандартного чистого микотоксина, при котором образуется зона задержки рос5 та дрожжей с Rf образца, равным Rf чистого микотоксина.

Выбор количества чистого токсина при хроматографировании определяется чувствительностью культуры дрожжей.

Выбор стандартизованного количества дрожжевых клеток в агаризованной среде 0,8-1 ° 10 (1 мл среды обеспечи6 вает такую плотность засева среды, при которой образуются четкие зоны задержки роста дрожжей при низких количествах микотоксина в пятне на хроматограмме). (Использование не применяемого ранее для выявления Т-2 токсина штам- р ма дрожжей Saccharomyces lactis BKNY459 повышает чувствительность способа на 30-40Х.

Способ осуществляют следующим образом. 15

Измельченное. зерно ржи, пшеницы и других зерновых культур. или зерно продукты экстрагируют хлороформом. ! . Отфильтрованный экстракт упаривают до полного удаления хлороформа, оста30 ток растворяют в определенном объеме хлороформа, наносят на хроматографические пластинки с тонким закрепленным слоем силикагеля последовательно ряд пятен образца в количест- 35 ве 1,3,5,7, 10, 12, 15 мкл и ряд пятен раствора Т-2 токсина в количестве

0,015у 0,02.; 0,03; 0,04; 0,05р 0,07;

О, 1 мкг, хроматографируют пластинки в системе бенэол-ацетон 3: 2, высушива, ют и заливают сусло-агаром, в которй внесен на 10,мл агара 1 мл суспен зии односуточной культуры дрожжей

Saccharnmyces lactis BKNY-459, содержащей 8 ° 10 клеток в мл . (10 еди- 45 б ниц по стандарту мутности), инкубируют пластинки во влажной камере

18"20 ч при 26-28 С, определяют наименьший объем исследуемого образца и наименьшее количество чистого токси- ;0 на Т-2, вызывающие образование на хроматограмме зон задержки роста дрожжей с Rf образца, равным Rf раствора чистого микотоксина, рассчитывают количество микотоксина Т-2 (Х) в испыту- 5 емом образце по формуле

А ° В

Х =

Б ° Г

4 4 где А — наименьшее количество микотоксина Т-2, которое выэывает образование эон задержки роста дрожжей на хроматограмме, мкг;

Б — масса исследуемой пробы продукта, г;

 — объем экстракта исследуемой пробы, мкл;

Г - наименьшее количество экстракта исследуемой пробы, которое дает задержку роста дрожжей на хроматограмме, мкл.

Пример, 1. 50 r измельченного зерна экстрагируют 200 мл хлороформа. Экстракт фильтруют, выпаривают в токе воздуха до полного удаления хлороформа, остаток растворяют в

5 мл хлороформа, наносят последовательно в количествах 1,3, 5, 7, 10, 12, 15 мкл на хроматографические пластинки. В качестве вещества-свидетеля наносят на те же пластинки 2 мкл чистого раствора Т-2 токсина в хлороформе 0,05 мкг/мкл. На другие хроматографические пластинки наносят последовательно пятна раствора чистого

Т-2 токсина с количеством микотоксина в пятне 0,015; 0,02; 0,03; 0,04;

0,01; 0,07; О, 1 мкг. Пластинки хроматографируют в системе бензол-ацетон

3:2 и высушивают. Далее проводят 4 варианта опыта для доказательства преимущества предлагаемого способа.

Вариант 1. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в который предварительно вносят суспенэию клеток односуточной культуры дрожшей штамма Saccharomyces lactis

BKNY-459 в стерильном физиологическом растворе в количестве 8 ° 10 клеток на 10 мл агара (i мл суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам стандарта мутности, на .10 мл сусло-агара) . Пластинки выдерживают во влажной камере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма BKNY-459. Наличие зоны угнетения роста дрожжей на хроматограмме с нанесенным исследуемым образцом с центром в точке, Rf которой равен Rf зоны, вызванной веществом-свидетелем, указывает на наличие в образце продукта микотоксина Т-2.

Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование

5 14244 зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме Г, 7 мкл. Наименьшее Количество чистого токсина Т-2, вызывавшее образ ование з оны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 5

0,02 мкг. Количество микотоксина

Т-2 (Х) в испытуемом образце зерна рассчитывают по формуле (А = 0,02 мкг), Б = 50 r, В = 5000 мкл, Г = 7 мкл)

0 02 мкг 5000 мкл

Х вЂ” - — — — — — — — — — 0,28 мкг/г

50 r 7мкл

Вариант II. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в кото-, рый предварительно вносят суспензию клеток односуточной культуры Штамма

Сапй da pseudotropicalis 44 пк. Нанесение культуры на хроматограмму 20 осуществляют по предлагаемому способу аналогично варианту 1 для сопоставимости чувствительности культур.

Культуру вносят в стерильном физиологическом растворе в количество 25

8 ° 10 клеток на 10 мл агара (i мп суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам стандарта мутности, на 10 мп сусло-агара).

Пластинки выдерживают во влажной 30 камере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста, штамма 44 пк., как в варианте 1.

Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование зоны задержки роста дрожжей на хро35 матограмме Г, 12 мкл. Наименьшее количество чистого токсина Т-2, вызвавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,03 мкг. Количество микотоксина

Т-2 (Х) в испытуемом образце зерна рассчитывают по формуле (А = 0,03 мкг, Б = 50 r В = 5000 мкл, Г = 12 мкл) .

Оа03 мкг 5000 мкл = 0 25 г!г 4

50 г 12 мкл

Вариант III. На поверхность плас- . тинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в который 50 внесены клетки односуточной культуры дрожжей Saccharomyces lactis BKMY459 в количестве 0,8-1 ° 108 в 1 мл, т.е. в 10 раз меньше рекомендуемого.

Пластинки выдерживают во влажной ка- 55 мере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма

ВКМУ-459. При таком количестве дрожжевых клеток в агаре четкие зоны за94 б держки роста дрожжей не выявляются, культура дрожжей растет в агаре в виде отдельных точечных колоний.

Вариант fy. Выполняют аналогично варианту 1, но вносят в сусло-агар

1 10 дрожжевых клеток в 1 мл, т.е.

8 в 100 раз больше рекомендуемого.

Пластинки выдерживают при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма ВКИУ-459, как в варианте

При таком количестве дрожжевых клеток в агаре на хроматограмме с нанесенным экстрактом исследуемого образца зерна зоны задержки роста дрожжей не выявляются. Наименьшее количество чистого токсина Т-2, вызывавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,05 мкг.

Из приведенного примера видно, что предлагаемый способ определения 4, 15диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)12, 13-эпокситрихотецена-3-ол (микотоксина Т-2) с использованием культуры дрожжей Saccharomyces lactis

BKMY-459 позволяет обнаружить на хроматограмме до 0,02 мкг микотоксина в пятне, тогда как применение пп амма

Candida pseudotropicalis 44 пк (при проведении всех остальных приемов анализа зерна аналогично предлагаемо- . му способу) позволяет обнаружить на хроматограмме до 0,03 мкг микотоксина в пятне. Таким образом, только за счет использования штамма Saccharomyces lactis BKMY 459 на 30-40 повышается чувствительность способа определения микотоксина.

Формула изобретения

Способ количественного определения в зерне и зерновых продуктах

4,15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси) -12, 13-эпокситрихотецена-3-on, предусматривающий экстракцию, нанесение экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующую ее хроматографию, обнаружение микотоксина с помощью специфической культуры дрожжей, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, параллельно с хроматографией экстракта хроматографируют ряд пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его 0,015-0,1 мкг в пятне, обе пластинки заливают агаризованной средой с внесенным в нее стандартизованным количеством дро юкевых кле1424494

Составитель.Л. Борисова

Техред JI.Îëåéíèê

Редактор Н.Федорова

Корректор Т.Палий

Заказ 4919

Тираж 788

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Мо«ква, Ж-35, Раушская набg, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 ток 0,.8-1 ° 10 на 1 мл штамма Saccharomyces lactis BKMY-459, определяют наименьшее количество стандарта микотоксина и исследуемого образца, 1 при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжей с Rf образца, .равным Rf чистого микотоксина.