Способ очистки щелочной фосфатазы

Авторы патента:

C12N9/16 - действующие на сложноэфирные связи (3.1)

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к препаративной биохимии. Цель изобретения - повышение удельной активности щелочной фосфатазы. Способ заключается вхроматографической очистке, причем в качестве сорбента используют фосфоцеллюлозу, сорбцию проводят при рН 5,3-6,5, а элюцмю - 8-12 мМ Na2HP04. Выход продукта по активности 80-84%, а удельная активность 750-770 ед./мг белка.

К сОюз coH(."1ских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s((s С 12 N 9/16

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф (1 ,СО (, ) (21) 4152924/13 (22) 28.11.86 (46) 07.11.92, Бюл, М 41 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов и Научна-производственное объединение "Биолар" (72) И.Ю.Сахаров, И.E.Màêàðîâà и Э,А.Аренс (56) Engstrom 1.. В(осЫгп. Blophls„Acta, 1961, ч,52, р, 36.

Авторское свидетельство СССР

М 1218677, кл. С 12 N 9/16, 1984.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и используется для получения очищенной щелочной фосфатаэы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе.

Цель изобретсния вЂ” повышение удельной активности щелочной фосфатаэы.

Способ заключается в том, что очистку препарата щелочной фосфатазы проводят на ионообменном сорбенте, причем в качестве сорбента используют фосфоцеллюлоэу, сорбцию проводят при рН 5,3-6,5, а элюцию вЂ” 8 вЂ” 12 мМ (чагНР04. Удельная активность полученной фосфатазы достигает

750-770 ед./мг белка против 70 вЂ” 194 ед./мг по известным способам.

Пример 1. 15 мг препарата щелочной фосфатазы, выделенной из тонкого кишечника тюленя (20 ед./мг белка), растворяют в

10 мл 10 MM фосфатного буфера рН 5,3, содержащего 1 мМ хлористого магния. Раствор фермента наносят на колонку с фосфо,, 50 ÄÄ 1426089 А1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗ Ы (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии.

Цель изобретения вЂ” повышение удельной активности щелочной фасфатазы, Способ заключается в хроматографической очистке, причем в качестве сорбента используют фосфацеллюлазу, сорбцию проводят при рН

5,3-6,5, а злюцию вЂ” 8 вЂ” 12 мМ Ма НРО (. Выход продукта по активности 80-84%, а удельная активность 75Ñ вЂ” 770 ед./мг белка, целлюлозой (2бх280 мм), уравновешенной буфером А, и атмыва(ат тем же буфером до оптической плотности раствора при 280 нм, равной 0,03, Фермент злюируют 10 мМ

Иа2НРО4. Ионообменную хроматографи(о проводят при 4 C. Скорость злюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментную активность обьединяют и вычисляют удельную активность полученного препарата щелочной фосфатаэы, которая равна 750 ед,/мг белка. Выход по активности 80%.

Пример 2. 15 мг препарата щелочной фосфатаэы тюленя (120 ед,/мг белка) растворя(от в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 5,8, содержащего 1 мМ хлористого магния. Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлоэой (26х280 мм), уравновешенной буфером А, и отмывают ионообменник тем же буфером до Арво = 0,03. Фермент элюируют 10 мМ И2НРО4. Ионообменную хроматографи(о проводят при 4 С. Скорость злюции 30 мл/ч, Фракции, содержащие ферментативную àктивность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелочной фосфатазы. Удельная лктив1426089

Формула изобретения

Способ очистки щелочной фосфатазы, e::n î÷aþùèé адсорбцию препарата щелочной фосфатазы на ионообменном сорбенте и элюцию целевого продукта водным буферным раствором, отличающийся тем, 4TQ, с i(GnbN3 повышения удельной активности целевого продукта, в качестве ионообменного сорбента используют фосфоцеллюлозу, адсорбцию проводят при рН

5,3-6,5, а элюцию осуществляют 8 вЂ” 12 мМ раствором натрия фосфорнокислого однозамещенного.

Составитель В.Муронец

Редактор Q,Стенина Техред М.Моргентan Корректор Е,Папп

Заказ 545 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагар! на. 101 ность равна 770 ед./мг белка, Выход по активности 84Я,.

Пример 3, 15 мг препарата щелочной фосфатаэы тюленя (120 ед./мг белка) растворяют в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 8,5, содержащего 1 мМ хлористого магния, Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26х280 мм), уравновешенной буфером А, и отмывают ионообменник тем же буфером до А2во = 0,03. Фермент элюиру от 10 мМ Na2HPQ4. Ионообменную хроматографию проводят при 4 С. Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелочной фосфатазы, Удельная активность равна 755 ед,/мг белка, Выход по активности 80 (, Верхняя граница рН обусловлена тем, что при рН выше б,5 сорбируемость щелочной фосфатазы на фосфоцеллюлозе резко уменьшается, что используется при элюции.

Нижняя граница рН обусловлена тем, что при рН ниже 5,3 наблюдается быстрая денатурация щелочной фосфатазы, Пример 4. 15 мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (НПО "Биолар") растворя от в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН

5,8 содержащего " мМ MgC!g (буфер А). Раствор фермента наносят на к. ланку фосфоцелл:Олозой (26х280 мм, уравновешенной буфером И, и отмывают тем же оуфером до

А2в0, равной 0.03. Фермент эл оируют 8 мМ

Na2ÍÐQ4. Ионосбменную хроматографию проводят при 4 С, Скорость элюции 30 мл/ч.- Фракции, содержащие ферментатив,ilo активность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелоч

;ION фосфатазы, котор-я равна 760 ед./мг балка, Пример 5. 15 мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (НПО Биолар") растворяют в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН

5,8, содержащего 1 мМ МОС!2. Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26x280 мм), уравновешенной буфером

А, и отмывают тем же буфером до А во. равной 0,03. Фермент элюируют 12 мМ

Nag/ pQ4, Ионообменную хроматографию проводят при 4"С, Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелочной фосфатазы, которая равна 745 ед,/мг белка, При использовании растворов Ма2НРО4 концентрацией ниже 8 мМ резко ухудшается элюция щелочной фосфатазы с сорбента.

Растворы NazHPQ4 концентрацией выше 12 мМ элюируют не только шелочную фосфатазу, но и ряд балластных белков, что приводит к понижению удельной активности целевого продукта.

При использовании вместо фосфата натрия растворов йаС1 вплоть до концентрации 0,5 M не наблюдается какой-либо десорбции фермента.

Изобретение позволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелочной фосфатазы при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья,

Похожие патенты:

Способ получения рестриктаз // 1406159

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, а именно к получению рестриктаз

Питательная среда для культивирования бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае вкпм в-1823 - продуцента рестриктазы крп i // 1402615

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении из биомассы рестрикционной эндонуклеазы Kpnl Для работ в биотехнологии и биохимии

Способ определения активности фосфолипазы а @ // 1364634

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии,в частности к определению активности одного из важнейших ферментов липидного метаболизма - фосфолипазы А{

Способ получения щелочной фосфатазы // 1287593

Изобретение относится к области получения очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в иммуноферментном анализе, научно- исследовательской работе и в производстве нуклеозидов из нуклеиновых кислот

Способ получения эндонуклеазы рестрикции eco rv // 1218678

Изобретение относится к области биотехнологии, может быть использовано в микробиологической промышленности для получения фермента, используемого в генетической инженерии

Штамм xanthomonas malvacearum в-2710 - продуцент эндонуклеазы рестрикции xmabi // 1152252

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения ферментов, имеющих прикладное значение, и может быть использовано в молекулярно-генетических работах по получению и исследованию рекомбинантных молекул ДНК с применением эндонуклеазы рестрикции Хma I

Способ получения холестеринэстеразы // 1151217

Способ получения фосфолипазы @ // 1125246

Способ получения эндонуклеазы рестрикции @ 1 // 1108106

Способ получения фосфолипазы @ // 1105502

Днк, кодирующая фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы (варианты), штаммы- продуценты фитазы (варианты), способ получения фитазы и рекомбинантная фитаза aspergillus niger // 2113468

Изобретение относится к микробиологическому производству фитазы

Бинарный вектор pmog413, бинарный вектор pmog429, способ получения трансгенных растений или растительных органов, содержащих увеличенное количество фитазы (варианты), и кормовая композиция (варианты) // 2128228

Хондроитиназа, способ ее получения и включающие ее фармацевтические композиции // 2144833

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается фермента хондроитиназы, применяемой в химико-фармацевтической промышленности, высокоочищенной хондроитиназы и способа получения фермента и фармацевтических композиций, содержащих фермент

Индуцируемый теплом промотор и его использование // 2230786

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к индуцируемым теплом промоторам, наборам и способам получения одного или большего количества белков с использованием индуцируемого теплом промотора

Штамм penicillium funiculosum, продуцирующиий комплекс ферментов - целлюлазу, эндо-1,4--ксиланазу, целлобиогидролазу, -глюкозидазу, эндо-1,3(4)- -глюканазу, ферулоил-эстеразу, жидкая кормовая добавка и сухой корм для сельскохозяйственных животных // 2261910

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в кормопроизводстве для приготовления кормовой добавки и корма для сельскохозяйственных животных

Полипептид, имеющий ферментативную активность фосфодиэстеразы // 2272841

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине

Гистидин-протеин-фосфатаза // 2281973

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и фармацевтике

Кристаллическая структура фосфодиэстеразы 5 и ее использование // 2301259

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к кристаллическим структурам фосфодиэстеразы 5 (PDE5) и комплексов "РDЕ5/лиганд PDE5" и к их применениям для идентификации лигандов PDE5, включая соединения-ингибиторы PDE5

Способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота // 2311455

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в производстве медицинских препаратов - рибонуклеазы панкреатической, дезоксирибонуклеазы панкреатической, трипсина, а также холестеролэстеразы

Способ количественного определения веществ антихолинэстеразного действия в водных растворах // 2358014

Изобретение относится к измерениям или испытаниям, использующим фермент холинэстеразу, конкретно к измерению концентрации веществ антихолинэстеразного действия (АХД), например фторангидрида O-изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИМФК), путем определения остаточной ферментативной активности