Штамм xanthomonas malvacearum в-2710 - продуцент эндонуклеазы рестрикции xmabi

 

(19)SU(11)1152252(13)A1(51)  МПК ⁶    _{C12N9/16, C12N1/20C12N9/16, C12R1:64}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 10.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) ШТАММ XANTHOMONAS MALVACEARUM В-2710 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ XMABI

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения ферментов, имеющих прикладное значение, и может быть использовано в молекулярно-генетических работах по получению и исследованию рекомбинантных молекул ДНК с применением эндонуклеазы рестрикции Хma I. Рестриктаза Хma I узнает последовательность ССС G G G в ДНК и производит специфический гидролиз фосфодиэфирной связи с образованием "липких концов", которые можно восстановить в двунитевую структуру с помощью ДНК-лигазы. Описаны векторы, способные к клонированию чужеродной ДНК с применением рестриктазы Хma I как селекцией по экспрессии вставленного фрагмента ДНК, так и по инактивации устойчивости к антибиотику (инзерционный инактивации) неэкспрессируемых фрагментов. Поскольку на широко применяемом векторе рВR 322 нет сайтов для рестриктазы Хma I, то указанная рестриктаза удобна для картирования клонированных фрагментов и введения делеций при наличии сайтов во вставках. Известно, что для получения Хma I используют Xanthomonas malvacearum АТСС 9924, который содержит интерферирующие эндонуклеазные активности Хma II и Хma III, затрудняющие получение чистого препарата Хma I. Кроме того, указанный штамм растет на дорогостоящих дефицитных средах, нестабилен при хранении, достигает стационара за 50-60 ч культивирования, содержит низкое количество фермента. 10 г сырых клеток содержат 1000 ед. активности. Целью изобретения является получение продуцента рестриктазы Хma BI - изошизомера Хma I, содержащего меньшее количество интерферирующих активностей, способного к глубинному культивированию на дешевых доступных средах, быстрее режущего, содержащего большое количество рестриктазы. Поставленная цель достигается получением штамма Хanthomonas malvacearum В-2710 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2710 - продуцента эндонуклеазы рестрикции Хma BI. Штамм Xanthomonas malvacearum В-2710 обладает следующими признаками. Культурально-морфологические признаки: клетки представляют собой палочки 0,6-0,8 на 1,5-3 мкм без признаков плейоморфизма, монотрихи, обладают подвижностью, в мазке располагаются поодиночке, грамотрицательны. Растут при температуре 5-32^оС, оптимум культивирования 25-28^оС. На глюкозокартофельном агаре при 5^оС образуют желтый пигмент. На плотной среде образуют большое количество внеклеточной слизи, с трудом рассеиваются до отдельных колоний. При культивировании в жидкой среде слизи не образуется. Подвижность лучше наблюдать под микроскопом в капле из жидкой среды, в полужидком агаре подвижность выражена слабо. Строгий аэроб, брожение отсутствует. Оксидазоотрицательны. Кислотообразование проверяют на средах с дрожжевым экстрактом и соответствующим углеводом. На средах с глюкозой, арабинозой, сахарозой, фруктозой, целлобиозой, галактозой наблюдается интенсивное кислотообразование, с ксилозой и мальтозой слабое, с лактозой, маннитом, сорбитом, инозитом закисления нет. Нитрат в нитрит не восстанавливают, молоко свертывает и пептонизирует, индол не образует, сероводород образует. Гидролиз желатины - на 7 сут, крахмала - в 1 сут, твина-80 - на 6 сут. Органические кислоты определяют в минимальной солевой среде с дрожжевым экстрактом. Лимонная и яблочная кислоты утилизируются хорошо, щавелевая кислота утилизируется плохо, уксусная не утилизируется. На МПА с 0,1% трифенилтетразолийхлорида роста нет. Реакция с метиловым красным и на ацетоин отрицательная. При глубинном культивировании выход биомассы зависит от партии среды. Хранение культуры необходимо осуществлять на средах, содержащих растительные экстракты. Наиболее предпочтителен глюкозокартофельный агар. Сусло-агар роста не поддерживает, при хранении на МПА культура через месяц не высевается. Названная культура хранится на чашках Петри с глюкозокартофельным агаром в течение 2-3 мес. при 5^оС, в течение 4 лет - на скошенном глюкозокартофельном агаре под слоем вазелинового масла при заливке маслом на несколько миллиметров выше верхнего края агара. Хanthomonas malvacearum В-2710 хорошо выдерживают лиофильную сушку. При посеве из лиофильно сухого состояния первый пассаж идет в течение недели, потом скорость роста восстанавливается. Физиолого-биохимические свойства штамма Xanthomonas malvacearum В-2710. При иccледовании биомаccы Хanthomonas malvacearum в ней обнаружена эндонуклеаза рестрикции Хma BI - изошизомер рестриктазы Хma I. П р и м е р. Глубинное культивированиe Xanthomonas malvacearum В-2710 проводят на среде следующего состава, г/л:
Пептон ферментативный ГОСТ 13805-76 10
Экстракт дрожжевой ТУ-6-09-3462-73 5 Натрий хлористый 5 КН₂РО₄ 2 Вода дистиллированная До 1 л рН 7
При посеве 10⁵ клеток /мл (28^оС) в медицинских колбах объемом 0,7 л в 200 мл среды за 30 ч культивирования при интенсивной аэрации на качалке со скоростью 120 об/мин культура достигает стационарной фазы роста и урожай составляет 4 г сырой биомассы с 1 л среды. Получение бесклеточного экстракта Xanthomonas malvacearum В-2710 1 г cерых клеток Хanthomonas malvacearum В-2710 суспендируют в 1-2 мл раствора следующего состава: 10 мМ трис-НСl, рН 7,4, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 1мМ ЭДТА. Обрабатывают ультразвуком (20 Вт, 20000 Гц) 4 мин сериями по 15 с и с перерывами по 45 с при 0^оС. Добавляют хлористый магний до 10 мМ, центрифугируют (21000 об/мин) 240 мин в роторе IA-20, центрифуге IA-21В (Бекман). Определение активности ХmaBI. В раствор состава: 10 мМ трис-НСl, рН 7,4, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл ДНК фага λ, объем смеси 10-20 мкл, добавляют 0,1-1 мкл лизата клеток Xanthomonas malvacearum В-2710. Инкубируют 10-30 мин при 37^оС, прогревают при 60^оС 5 мин и анализируют электрофорезом в 0,7-0,9%-ном агарозном геле. 1 г сырой биомассы содержит 0,6-1,2 т. ед. активности. Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным:
содержит одну рестриктазу вместо трех: XmaI без XmaII и XmaIII;
для глубинного культивирования используется среда на основе пептона ферментативного и экстракта дрожжевого вместо питательного бульона Дифко (США);
время достижения стационарной фазы роста около 30 ч, что в 1,5 раза меньше, чем у штамма Xanthomonas malvacearum АТСС 9924; содержание рестриктазы XmaBI в штамме Xanthomonas malvacearum В-2710 600-1200 ед на грамм сырой биомассы, в штамме АТСС 9924 в десять раз меньше. Кроме того, следует отметить, что штамм устойчив при хранении в различных условиях.

Формула изобретения

ШТАММ XANTHOMONAS MALVACEARUM В-2710 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ XMABI. Штамм Xanthomonas malvacearum В-2710 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2710) - продуцент эндонуклеазы рестрикции Xma BI.