Способ получения холестеринэстеразы
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЭСТЕРАЗН , предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, отличающийся тем, что, с целью повьшения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или Pseudoraonas spec, DSM 1280, a в качестве индуктора лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2% от массы среды. (Л
СО)03 СОВЕТСКИХ к к
РЕСПУБЛИН (19) () )) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2966345/28-13, 2966346/28-13 (22) 15.08.80 (31) Р 2933646.7, Р 2933648.9 (32) 20.08.79, .(33) ФРГ (46) 15.04.85. Бюл. ) 14 (72) Клаус Бокамп (ФРГ), Михаель Нельбоек (Австрия), Хельмгард Гауль (ФРГ), Ханс Зайдель, Вольфганг Грубер (ФРГ) и Хервиг Бруннер (Австрия) (71) Берингер Ианнхайм ГмбХ (ФРГ) (53) 577.1.5(088.8) (56) 1. Патент Франции В 2362927, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1978.
2. Патент Франции 9 2274686, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1976 (прототип).
4(51) С 12 И 9/16 С 12 R 1/38 (54) {57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЗСТЕРАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas
spec. DSM 1281 или Pseudomonas spec.
DSN f280, а в качестве индуктора— лецитин или соевый лецитин в количестве 0",5-2Х от массы среды.
1 1151
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестеринэстеразн.
Известен способ получения холестеринэстеразн (1), предусматривающий культивирование продуцирующего штамма
Nocardia chofestегоEicum NRRL 5767 или NRRL 5768 на питательной среде, содержащей необходимые минеральные соли и индуктор - холестериновый эфир или холестерин в количестве
1-10 г/л и экстракт дрожжей с последующим выделением фермента. Максимальная активность фермента — 49,2.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения холестеринэстеразн (2)., предусматривающий культивирова- 2О ние продуцирующих штаммов Pseudomonas й1иогезсепз KY 3955, 4032 .и т.д, на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор — холестериновый эфир с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток.
Согласно способу используют питательную среду, содержащую, г!л: холестериновый эФир 5, кукурузный экстракт 2, NANO» К НРС 1, NgSO4 7Н 0 2 ° фермента - 17.
Известным способам присущ общий недостаток — низкая активность фер35 мента.
Цель изобретения — повышение активности целевого продукта, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения 40 холестеринэстеразн, предусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы
Pseudomonas spec. DSN 1281 или Pseudomonas spec. DSN 1280, а в качестве индуктора — лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2 от массы среды.
Применяемые B соответствии c Hso 5 бретением микроорганизмы являются очень похожими и обладают следующие признаки: грамотрицательный; обяза217
3 г
1 г
0,05 г
0,1 мл l,0 мл
50мл
1,5%
7,0
Культивирование производили при
30 С в качалочной колбе при соблюдении.аэробных условий. Через 2 суток достигается активность приблизительно 1500 ч/л (раствор и биомасса: субстрат : холестерилолеат), тельно аэробный; желтоватые колонки на агаре из пептонов мяса рост при о
У
25, 30 и 37 С; отсутствие роста при
10, более 41 С; размер клеток от
0,8 до 1 мкм, от 2 до 4 мкм; подвижность, lophotrich hegeipelt; склонность к образованию цепей, отсутствие спор или продолжительных стадий: цитохром — оксидаза +; каталаза + ; индол-; нитрит-; желатина-; моносубстрат — деструкция: адонит +; цитрат +; галактоза +; глюкоза +; изонит +; лактоза +; маннит +; манноза +; салицин +; сорбит +.
Процесс культивирования ведут в аэробных условиях при 15-45 С, предпочтительно между 25 и 35 С используя посевные культуры, выращенные на качалке или на воздухе — Pumbersкультуры. Максимальный выход достигается после 1-2 суток культивирования.
Пример 1. Штамм Pseudomonas
spec, DSN 1280, перенесенный из охлажденной до низкой температуры ампулы в пробирку со скошенным агаром, предварительно культивировали в течение двух суток в основной культуральной среде при 30 С в аэробных условиях (качалочная колба) и затем в количестве до 10% пересевали в среду, которая имела на 1 л воды следующий состав:
Двузамещенный фосфорнокислый натрий 7 r
Однозамещенный фосфорнокислый калий
Хлористый аммоний
Хлористый натрий
1%-ный раствор хлорного железа 0,1 мл
0,2 -ный раствор хлористой меди
1 -ный раствор сернокислого цинка 0,1 мл
10 .-ный раствор хлористого кальция
12 -ный раствор сернокислого магния
Соевый лецитин рН
11512
1. Холесте- Холестеринриновый+ экстераза Н О эфир
Холестерин+ 15
+кислота жирного ряда
2. Холесте- Холестеририн+1/2 О> ноксидаза (катализа) Холестенон+
2 2 20
Составитель И.Привалова
Редактор С.Тимохина Техред O.Âàùèøèíà Корректор Е. Сирохман
Заказ 2191/47 Тираж 525 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Примерно такой же выход получали в том случае, когда при прочих равных условиях вместо Pseudomonas spec. DSM
1280 применяли Pseudomonas зрес.
DSM 1281. 5
Пример 2. Из культурального раствора, полученного в соответствии с примером 1, выделяли центрифугированием нерастворимую клеточную массу и применяли ее для определения хо- 10 лестеринового эфира. Определение производили в соответствии со следующей схемой реакций:
Для измерения применяли следующие растворы:
17
1. Фосфатный буфер 0,5 M, pH 7,5, 0,47 тезита.
2. Холестеринолеат с = 4 в тезитдиоксане (ч/v = 1/1) .
3. Н>0< примерно 0,6 м (5 мл пергидрола/100 мл).
4. Каталаза (0,01 мг белка/мл).
5. Холестериноксидаза (мин. 50 v/ìë).
6. Культуральный раствор (примерно
5000 ч/л, 1:5 разбавленный Н>О, 0,01 мл тест).
Для измерения 2,95 мл раствора 1 смешивают с 0,02 мл раствора 3.
Через 5 мин добавляют 0,01 мл раствора 6 и 0,02 мл раствора 5 и спустя
1 мин инициируют реакцию добавлением 0,1 мл раствора 2.
Расчет осуществляют по формуле
3 12 5 t000
- — — — - а Е/мин = v/ë культу—
15,5" 0 01 рального раствора.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить активность холестеринэстеразн.
