Питательная среда для культивирования бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае вкпм в-1823 - продуцента рестриктазы крп i

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении из биомассы рестрикционной эндонуклеазы Kpnl Для работ в биотехнологии и биохимии. Целью изобретения является повьшение выхода биомассы . Компоненты питательной среды подобраны экспериментально в два этапа с помощью ЭВМ по программе дробнофакторного планирования для ДФЭ-2 Предложены концентрации компонентов среды, мас.%: глюкоза 0,6-0,65; пептон 1,6-1,7; дрожжевой экстракт 1,2-. 1,3; двузамещенньй фосфорно-кислый натрий 0,85-0,87; аммоний хлористый 0,37-0,40; магний сернокислый сейиводный 0,02; вода дистиллированная - остальное. Питательная среда обеспечивает высокий выход сырой биомассы (л-ЗО г/л) и фермента (.т-Ю-Ю ед. на 1 г сырой биомассы). 2 табл. S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (511 4 С 12 Н 1/20, 9/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ЗСР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, !3 „

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«.. (21) 4190099/28-13 (22) 17. 11. 86 (46) 15.06.88. Бюл. ¹ 22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт. прикладной микробиологии (72) 3 Ф. Бунина и В.В. Смолянинов (53) 577 ° 15(088.8) (56) Патену Великобритании ¹ 2021415, кл;,А 61 К 35/74, опублик. 1979.

Методы общей бактериологии/Под. ред. Ф. Герхардта. M.: Мир. т. 1, 1983, с. 216-230. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE BKIIN В-1823-ПРОДУЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ KpnI (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано

„„SU„„1402615 А 1 при получении из биомассы рестрикционной эндонуклеазы KpnI для работ в биотехнологии и биохимии. Целью изобретения является повьппение выхода биомассы. Компоненты питательной среды подобраны экспериментально в два этапа с помощью ЭВМ по программе дробно5-1 факторного планирования для ДФЭ-2

Предложены концентрации компонентов среды, мас.7.: глюкоза 0,6-0,65; пелтон 1,6-1,7; дрожжевой экстракт 1,2-.

1,3; двузамещенный фосфорно-кислый натрий 0,85-0,87; аммоний хлористый

0,37-0,40; магний сернокислый семиводный 0,02; вода дистиллированная остальное. Питательная среда обеспечивает высокий выход сырой биомассы (30 г/л) и фермента (е10 104 ед. на

1 г сырой биомассы). 2 табл.

1402615

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении из биомассы рестрикционной эндонуклеазы для биотехнических работ и биохимии.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы.

Приготавливают питательную среду из расчета на 1 л следующим образом.

Пептон и дрожжевой экстракт взвешивают и растворяют в 200 мл воды, кипятят 15-20 мин, охлаждают, доводят рН . до 7,0-7,2 и осадок отделяют на центрифуге при 6000 об/мин в течение 15

20 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют соли, глю козу, воду до метки. Проверяют рН среды, при необходимости доводят до

7,0-7,2 и стерилизуют при давлении 20 в 1 атм в течение 30 мин.

Результаты культивирования клеток в средах 1-4 представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, через 5 ч.клетки растут следующим об- 25 разом. В средах 2 и 3 с меньшей концентрацией компонентов рост хуже изSa начинающегося голодания клеток, В среде 4 с большей концентрацией компонентов рост не улучшается по от-30 ношению к росту клеток на среде 1.

Следовательно, выбранная концентрация компонентов среды является оптимальной.

Пример 1. Для сравнения выхода сырой биомассы проводят параллельНое культивирование К.pneumoniae (0K8) ВКПМ В-1823 в предлагаемой среде и контрольной среде (известное).

Предлагаемая среда, г/л: глюкоза 6,5;,!О пептон 17; дрожжевой экстракт 13; !

1а НРО 8,7; NH(C1 4,0; MgSOg 7Н О

0,02, вода дистиллированная до 1 л.

Среда (контроль), г/л: глюкоза 1;

NaCl 10,0; дрожжевой экстракт (Difco) 45

5; бакто-пептон (Difeo) 10, вода дистиллированная до 1 л, рН сред 7,0.

Выращивание проводят в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл в

200 мл среды при 37 С с качанием 200250 об/мин. Оптическую плотность суспензии клеток выражают в оптических единицах (о.e.) и замеряют на прибо— ре фотоэлектрокалориметр КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете толщиной

5,05 мм. Пробы отбирают одновременно.

Результаты представлены в табл. 2.

По результатам табл. 2 видно, что .рост клеток на предлагаемой среде в

Формула изобретения

Питательная среда для культивиро" вания бактерий Klebsiella pneumoniae

ВКПМ В-1826 — продуцента рестриктазы

KpnI, содержащая глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт, минеральный источник натрия и хлора и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, она дополнительно содержит сернокислый семиводный магний, в качестве источника натрия — двузамещенный фосфорнокислый натрий, а источника хлора — хлористый аммоний, при следующем соотношении компонентов, мас ° 7.:

О, 60-0,65

1,6-1,7

Глюкоза

Пептон

Дрожжевой экстракт

Хлористый аммоний

1,2-1,3

0,37-0,40 два раза лучше, чем на известной.

Кроме того, эксперименты показали прямую корреляционную зависимость между ростом клеток и накоплением фермента, поэтому клетки осаждают из культуральной жидкости к концу логарифмической фазы роста. Выход сырой биомассы на предлагаемой среде в 3-5 раз выше, чем на известной, Следовательно, и общий выход фермента выше.

Концентраций рестрикционной эндонуклеазы KpnI в грузом клеточном экстракте после разрушения клеток ультра" звуком составляет,-10-18 .10 усл.ед. на 1 г .сырой биомассы. 3а единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК фага о при 37 С за !5 мин. Рестрикционные эндонуклеазы, получаемые из биомассы, являются ценными препаратами, используемыми для научных исследований, к ним предъявляются высокие требования по активности и чистоте.

Таким образом, питательная среда включает компоненты, используемые в микробиологической промышленности.

Совокупность компонентов в предлагаемой среде, подобранной по результатам двухэтапного дробно-факторного эксперимента на ЭВМ, позволяет получать клетки К,pneumoniae ОК8 в количестве 20-30 r с 1 л среды.

1402615

0,015-0,020

0,85-0,87

Остальное

Т а блица 1

Результаты культивирования К,pneumoniae ОК8

Среда

Оптическая плотность, оптические единицы, при времени культивирования, ч

3 5 .6 10

07 21 27 37

1,5

0,28

0,7 1,9 2,3 2,8

0,27

0,7 1,6 1,7 2,5

0,26

0,7 2,1 2,7 3,2

0,27

Таблица 2

Концентрация клеток К.pneumoniae ОК8 на предлагаемой среде и . известной

Выход сырой биомассы, г предла- контгаемая роль предла- контгаемая роль

4,5

3,1

1,9

4,6

2,9

8,0

4,0

Составитель И. Привалова

Редактор Н. Киштулинец Техред A.Êðàâ÷óê . Корректор C. Шекмар

Заказ 2826/18 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Двузамещенный фосфорнокислый натрий

Сернокислый

Время роста, ч

Оптическая плотность куль"гуры (о.е4) в среде семиводный магний

Дистиллированная вода

4 3

6- 4

20-30 6-7