Способ получения рестриктаз

 

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, а именно к получению рестриктаз. С.целью упрощения процесса выделения целевого продукта и повьшения его активности исходные клетки микроорганизмов - продуцентов рестриктаз в процессе разрушения ультразвуком подвергают термообработке при температуре от 50 до бО с в течение от 3 до 10 мин, центрифугируют , а надосадок используют для дальнейшей хроматографической очистки целевого продукта при комнатной температуре . о (Л 4 о Од ел ;о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (SI) 4 C 12 N 9/16, t/20//(C 12 N 9/16, С 12 R 1:01) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,:;-, "

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ к

"а (21) 4080579/28-13 (22) 20.06.86 (46) 30.06.88. Бюл. !1к 24 (71) Научно-исследовательский конструкторскб-технологический институт биологически активных веществ (72) Л.И.Пучкова и Г.Д,Серов (53) 577.15 (088.8) (56) Таняшин В.И. Рестриктирующие эндонуклеазы (Молекулярная биология).

Итоги науки и техники. М., 1979, т. 12, ч. 1, с.58-91.

Hines J.L, Chauncey Т.R., Agarwall К.L. Preparation and properties of the Нра 1 and Нра 11 endonucleases — In: Methods in enzymology, N.Y. 1980, v. 65, part 1; р.153-163.

Бондарь Т.С., Зернов Ю.П., Пустошилова Н.М. Получение ферментов, изучение их свойств и механизмов их действия. В кн.: Всесоюзная итоговая конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". Латвийский гос. ун-т им.П.Стучки, Рига, 1985, с.41-44.

Майстренко В.Ф. и др. Метод выявления высокоочищенной рестриктазы

Хва 1. — Биотехнология, M. 1986, 1, с.26-30.

„„SU„„1406159 A 1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРНКТА3 (57) Изобретение относится к биохимии и микробиопогии, а именно к полу" чению рестриктаз. С целью упрощения процесса выделения целевого продукта и повышения его активности исходные клетки микроорганизмов - продуцентов рестриктаз в процессе разрушения ультразвуком подвергают термообработке при температуре от 50 до 60 С в течение от 3 до 10 мин, центрифугируют, а надосадок используют для дальнейшей хроматографической очистки це" левого продукта при комнатной температуре. I 406159

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению и очистке рестриктаз, синтезируемых микроорганизмами. 5

Цельй,изобретения является упрощение процесса выделения целевого продукта.

Способ заключается в следующем.

Клетки бактерий вносят в охлажден-10 ный буфер и подвергают дезинтеграции ультразвуком, доводя температуру (она повышается в процессе дезинтеграции) до 50-60 С, выдерживая при этой температуре 3-10 мин, затем экстракт 15 освобождают центрифугированием от дебриса клеток, а надосадок используют для хроматографии. Полученные фракции исследуют на наличие. фермента, объединяют и диализуют против 50 ного раствора глицерина. Все стадии выделения фермента .проводят при комнатной температуре.

Данный способ термообработки грубых клеточных экстрактов был апроби- 25 рован для рестриктаз: Хва I Xma .I, Нра I,II, Hinf I, Hha I,. Нае II,III, Bgl II, Ара I, Sau 96 I. Выделение рестриктаз после термоинактивации примесных ферментов на стадии получе-30 ния грубого экстракта .клеток микроорганизмов позволяет исключить многостадийное фракционирование, ускорить процесс выделения, упростить его и повысить выход целевого .продукта. 35

Вследствие того, что примесные проте— олитические ферменты инактивируются на первой стадии и рестриктазы ими. не гидролизуются на последующих стадиях, процесс выделения в дальнейшем 40 можно проводить при комнатной температуре.

Оптимальными являются температуры

50-60 С, при которых происходит инактивация неспецифических ферментов в 45 течение 3-10 мин, что позволяет проводить выделение указанных ферментов даже из биомасс микроорганизмов, содержащих большое количество неспецифических нуклеаз.

Пример 1. Выделение рестриктазы Hha I.

1,.0 r влажных клеток бактерии Haemophilus haemolyticus суспендируют в

4.мл 0,4 M NaCl в буфере А (10 MM

К-фосфатный буфер, рН 7,5; 10 мИ

2-меркаптоэтанола, 1 мМ Ма — ЭДТА) с добавлением тритона Х-100 до 0,1 . о

Смесь охлаждают до 6 С и подвергают дезинтеграции ультразвуком на дезинтеграторе ."МБЕ" (Англия) с помощью конического стержня с диаметром нижнего конца 3 мм. Разрушение проводят при амплитуде "15" в течение 3 мин

15 с под контролем термометра до досо тижения 50 С, а затем охлаждают до

4-6 С.

Затем освобождаются от дебриса о клеток центрифугированием при

18000 об/мин в течение 30 мин. Полученный экстракт разбавляют в 2 раза

0,01 M калийфосфатным буфером,рН 7,5, содержащим 10.мИ 2-меркаптоэтанола, .

1 мМ трилона Б, и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P. 11 ("ИаИппап").

Элюцию сорбираванных белков проводят линейным градиентом NaCl в буфере А

Отбирают фракции объемом 0,8-0,9 мл и анализируют на содержание рестриктазы. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в 40 мл реакционной смеси, содержащей 1 мкг фага ламбда, 7,5 мМ трис-НСl,рН 7,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанола,6 мМ MgSO<, 0,1 M NaC1. Гидролиз о проводят в течение 15 мин при 37 С.

Затем вносят 10 мкл смеси Б (додецилсульфат натрия 0,2, трилон Б 34 ., сахароза 50% бромфеноловый синий

0,025 ). Пробы наносят на 1,4 -ный агарозный гель и проводят электрофо„рез.

Фракции, содержащие фермент, объе диняют. Активность фермента после хроматографии на фосфоцеллюлозе P-11 в среднем составила 27 тыс.ед.акт./г биомассы, удельная активность—

2400 ед.акт./мг.

Фермент не содержал существенных примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз, как следовало из данных по длительному (174) гидролизу ДНК фага

Т7 и тесту рестрикция — лигирование— рестрикция.

Пример 2. Выделение рестриктазы Хва I.

1,0 r влажных клеток бактерии Xantomonas ЬайгЫ суспендируют в 4 мл буфера (10 мМ трис-НС1 рН 7,9; 10 мИ

2-меркаптоэтанола) с добавлением до

0,1Х тритона Х-1ОО, охлажденного до

6 С, и подвергают дезинтеграции ульт" развуком при частоте 20 кГц и ампли- о туде 15 мкм до 55 С в течение 3 мин.

Затем освобождаются от дебриса клеток путем центрифугирования при 18000 об/

/мин в течение 30 мин (I2-21, фирма

14061

"Bec kman"). Полученный экстракт разбавляют в 2 раза 0,01 M калийфосфатным буфером,рН 7,5, содержащим 10 MM

2-меркаптоэтанола, 1 мМ .трилона Б,10Ж,глицерина (буфер А), и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков проводят линейным градиентом КС1..Фермент элюируется

КС1 при концентрации 0,3-0 5 M.. Отби- 10 рают фракции объемом 0,8-0,9 мл и анализируют на содержание рестриктазы Хва I. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в 40 мкл реакционной сме.си, содержащий 1 мкг IIHK йага Т7: 15 б мМ трис-НСl,pH 7, 9;6 мИ 2-меркаптоэтанола; 6 мМ MgC1 . Гидролиз проводят в течение 15 мин при 37 С. Затем в каждую пробу вносят 10 мкл смеси Б.

Пробы наносят на 0,87.-ный агарозныи 20 гель и проводят электрофорез в 90 мМ трис-боратном буфере рН 8,3, содержащем 2,5 MM трилона Б. Электрофорез ведут в течение 2 ч при силе тока

50 мА. Затем гели окрашивают этидиум- 25 бромидом (5 мкг/мл) и просматривают в ультрафиолетовом свете. Фракции, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют в 50Х-ном растворе глицерина, содержащем 10 MM 2-меркаптоэтано- 30 ла, 1 мМ трилона Б. Активность полученного фермента Хва I из 1,,0 г влажных клеток составляет 5000 ед. активности, что в 2 раза выше,чем при получении известным способом. Хранится о фермент при температуре - 10 С.

Пример 3. Выделение рестрик,тазы Xma I. (Xanthomonas malia cearum).

Вьщеление рестриктазы проводят, 40 как указано в примере 1, за исключением того, что клетки разрушают без термообработки (на ледяной бане) при температуре не выше 10 С 5 раз по о

45 с с интервалом 45 с с последующим их прогреванием 10 мин при 50 С на водяной бане ° Активность полученного после фосфоцеллюлозы P-11 фермента

Хша I составила 200 ед.акт./r биомассы. 50

Пример 4. Вьщеление рестрик-. тазы Xma I.

Вьщеление проводят аналогично примеру 3, за исключением того, что клетки после разрушения не подвергали термообработке. Активность фермента составила 50 ед.акт,/г биомассы.

Пример 5. Выделение рестриктазы Нае II (Haemophilus aegyptius).

59

Выделение проводят, как указано в примере 1, за исключением того, что

1,0 r клеток разрушают 4 мин до дос» тижения температуры экстракта 51ОС.

Активность фермента Hae II составила

2600 ед.акт./r биомассы. Фермент сохранил 50Х активности через 9 мес хранения при температуре -10 С.

Пример 6. Выделение рестриктазы Hha

Вьщеление проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что клетки в процессе разрушения и после него не подвергали термообработке.

Фермент не выделен из- за большого количества неспецифических нуклваз.

Пример 7. Выделение рестрик" тазы .Hinf I.

1,0 г влажных клеток бактерии Hae mophilus influenzae В-2296 суспенди- руют в 4 мл буфера (1О мИ трис-НС1, рН 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанола), охлажденного до 6 С, и подвергают де-. зинтеграции ультразвуком при частоте

20 кГц и амплитуде 15 мкм до достижео ния температуры 60 С и выдерживают при ней в течение 5 мин.

Выделение проводят, как в примере 1. Активность полученного фермента Hinf I из 1,0 r влажных клеток составляет 10000 ед.актнвности, что почти в 70 раз вьппе получения известным способом, Фермент хранится при температуре -10 С.

Пример 8. Вьщеление рестриктазы Нае III.

Вьщеление проводят из 1 r клеток бактерии Haemophilus aegyptius В-2709, как в примере 1. Термообработку проводят при 50 С 10 мин. Фермент элюируется раствором NaC1 при концентрации 0,8-1;0 M. Активность выделенного фермента Нае III из 1,0 г влажных клеток составляет 10000 ед.активности. Хранят фермент при температуре

-10 С.

Пример 9. Вьщеление рестриктазы Нра I, II.

Выделение проводят из 1,0r клеток бактерии Н. parainfluenzae, как в примере 1. Термообработку проводят при 40 С 10 мин. Фермент выделен не был из-за большого количества неспецифических нуклеаэ.

Пример 10. Вьщеление рестриктазы Hinf

Выделение проводят,как в примере 1 ° о

Термообработку проводят при 65. C

1406159

10 мин. Количество фермента, выделенное в 1 г биомассы, снизилось,о чем свидетельстЪует наличие недорестрикции субстрата в стандартных условиях определения активности.

Формула изобретения

Составитель Н. Ходарев

Редактор Н.Швыдкая Техред А. Кравчук КоРРектоР И.Эрдейи

Заказ 3157/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения рестриктаэ, вклю- 10 чающий получение грубого экстракта путем разрушения. исходных клеток микроорганизмов ультразвуком и освобождения от дебриса клеток центрифугированием, хроматографическую очистку целевого фермента и диализ в 507-ном растворе глицерина, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения процесса выделения целевого продукта и повышения его активности, клетки при разрушении подвергают термообработке при температуре от 50 до

60 С в течение от 3 до 10 мин.