Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов, в частности способа получения пептидов общей формулы: R,Rj-L-Tyr-A-Gly- B-C-D-E-F, где R, R Н или R т э R,: Н и С,-С4-алкш1, А Gly; D-Cys, связанный с С, если С Cys; В Phe или (n-N05)Phe; С ;Leu, Met(O), Cys, связанный с А, если А D-Cys; D Arg, CH,-Arg, Lys; E Arg, CHj- Arg; F NH, D-Leu-X (при X OH, NH, OCjHy, ,.) или D-Leu-Arg-X . (при X NH, ), обладающих анальгетической активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут фрагментарной конденсацией мето- .дом постепенного наращивания пептидной цепи, исходя из БОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов. В случае необходимости от полученного защищенного пептида отщепляют имеющиеся защитные группы. Новые пептиды обладают анальгетической активностью при эффективной дозе ЕДуо 0,22-,5 мг/кг (внутривенно) и 0,32-1,5 мг/кг (подкожно ), против 25 мг/кг для динорфина, при токсичности 20 - 100 мг/кг. 6 табл. ш 43 С«9 сд

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТЬИЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPblTMA (21) 3974503/23-04 (22) 06.11.85 (31) 236076/84 (32) 09. 11.84 (33) JP (46) 23. 10.88. Бюл. В 39 (71) Зисаи Ко.9 Лтд (JP) (72) Хироси Есино, Ютака Цутия, Такеру Канеко, Такахиро Наказава, Масухиро Икеда, Син Араки, Киеми

Ямацу, Синеро Татибана и Есихиро

Аракава (ЛР) (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Шредер Э., Любке К. Пептиды.

M. Мир, 1967, т. 1, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности способа получения пептидов общей формулы: R,К -L-Tyr-А-GlyB-С-D E F, где R) = R = Н или Rg Ф К,; Н и С,-С -алкил, А Gly; D-Cys, связанный с С, если С = Cys; В РЬе или (п-БО, )РЬе; С =.Leu, Met(0), Cys, связанный с А, если А = D-Суе; 9,„Я0„„14ЗЗ415 А3 р 4 С 07 К 7/06//А 61 К 37/02

= Arg, СНз-Arg, Lys; Е Arg, СНзArg; F = ИН„, D-Leu-X (при Х ОН, NH, ОС Н, NHC H ) или 0 Leu-Arg-X . (при X = NH, NHC H } обладающих анальгетической активностью, что может быть использовано в медицине.

Цель — создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут фрагментарной конденсацией мето.дом постепенного наращивания пептидной цепи, исходя из ВОС защищенной

С вЂ” конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов. В случае необходимости от полученного защищенного пептида отщепляют имеющиеся защитные группы. Новые пептиды обладают анальгетической активностью при эффективной дозе ЕД = 0,22-4,5 мг/кг (внутривенно) и 0,32-1,5 мг/кг (подкожно), против )25 мг/кг для динорфина, при токсичности Ж о 20—

100 мг/кг. 6 табл.

1433415

Изобретение относится к способу получения пептидов — новых биологи чески активных соединений, которые могут найти применение в медицине, Цель изобретения — получение новых пептидов, обладающих более высокой анальгетической активностью.

Пример 1. Синтез СН -Тир,"Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Д-Лейз

ИНС Н

А. Растворяют в 200 мп тетрагидрофурана 25 r БОК-D-Лей-0Н Н О.Расто вор охлаждают до -20 С и добавляют ! в него 11 мп N-метилморфолина и ,9,56 мл этилового эфира хлоруголь ной кислоты. Через 5 мин добавляют в раствор 12,9 r 70X-ного водного раствора этиламина и смесь переме9 о шивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате и промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно.

После концен уирования досуха получают 24,5 г БОК-Д-Лей-МНС Н .. Т.пл. 103106 С.

Тонкослойная хроматография (ТХС): значение Rf 0 77 (этилацетат). Опти.—

В о ческое вращение: (а) = +?0,0 (С=1, метанол) .

Вычислено, : С 60,44; Н 10,14;

N 10,84.

C,S H 26N<03

Найдено, Ж: С 60,42; Н 10,33;

N 10,86.

Б, Синтез Z-СН Арг(Тос)-Д-ЛейФС,Н,.

Растворяют в 15 мл тетрагидрофурана 1,43 г Z-СН Арг(Тос)-ОН, (а)

-15о, С=1, диметилформамид, синтезированного из Н-Арг(Тос)-OH. После охлаждения до -30 С в раствор добаво ляют 0,33 мл N-метилморфолина и

0,29 мп этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь до,бавляют раствор 817 мг CF СООН.Н-Д-Лей-NHC

БОК-Д-Лей-NHC Н трифторуксусной кисг 5 лотой в присутствии анизола) и 0,83 мл триэтиламина в 7 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После концено трирования остаток растворяют в этилацетате, промывают. водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. последовательно и концентрируют досуха, получая 1,58 r стеклообразного Z-CH Apr.(Тос)-Д-Лей-ИНСгН .

TCX: значение Rf 0 68 (метанол/

/хлороформ = 1/7).

Вычислено, 7.:. С 58,42; Н 7,19;

К 13,63.

С„, Н„1 1, О,Б

Найдено, X: С 58,29; Н 7,19;

N 13,40.

В. Синтез БОК-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)Ъ

Д-Леи-ИНСгН .

Растворяют в 4 мл диметилформамида 1,1 г ".Н Арг(Тос)-Д-Лей-ЯНС Н полученного каталитическим восстановлением Z-.CHApr(Toc)-Д-Лей-ИНС Н в присутствии катализатора Pd/C, 983 мг .БОК-Apr(Toc)-OH и 372 мг N-гидроксибензотриазола. В этот раствор при охлаждении льдом добавляют 520 мг дициклогексилкарбодиимида, и смесь

20 перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Полученные таким образом осадки отфильтровывают, а фильтрат концентрируют. Концентри25 рованный остаток очищают с помощью хроматографии на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/СНС1>

1/ 15), чтобы получить 1,2 r стеклообразного продукта БОК вЂ А(Тос)-СН 30 -Арг(Тос)-Д-Лей-МНС Н .

ТСХ: Rf 0,64 (метанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: ° (а)

= -20,6 (С=1, метанол), Вычислено, Ж: С 52,72; Н 7,30;

35 И 15,37.

С4о Н64N о О S НгО

Найдено, Е: С 52,82; Н 7,22;

N 15,06.

Г. Синтез БОК-Лей-Арг(Тос)-СН Арг (Тос)-Д-Лей-NHC Í .

Растворяют в 12 мл диметилформамида 1,645 г БОК-Лей ОН ° НгО. Раствор охлаждают до -20 С и добавляют в него о

0,726 мл N-метилморфолина и 0,631 мл этилового эфира хлоругольной кислоты.

Через 5 мин к раствору добавляют раствор 4,986 г СР СООН.H-Арг(Тос)-CH>Apr(Тос)-Д-Лей-NHC

50 (Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-NHC Н три3 г 5 фторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,726 мл N-метилморфолина в 12 мл диметилформамида, и смесь о перемешивают приблизительно при -5 С

55 в течение 2 ч ° После концентрирования и последующего отвердевания с помощью смеси метанол/эфир получают 5,283 r

БОК-Лей-Арг(Тос)-CH Арг(Тос)-Д-Лей3 о

-NHC H . Т. пл. 120-125 С (разложение).

1433415

5Р

ТСХ: Rf 0,66 (метанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: (а) о

Э

25,8 (С=1, метанол) .

Вычислено, 7.: С 54,36; Н 7,67;

N 14,84.

С46Н.,p „ О <о Б СКЛОН

Найдено, Х: С 54,49; Н 7,63;

N 14,62.

Д. Синтез БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН>Apr(Тос)-Д-Лей-NHC

Растворяют в 12 мл диметилформамида 1,465 г БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают до -30 С и добавляют в него

0,608 мл N-метилморфолина и 0,528 мл этилового эфира хлоругольной кислоты.

Через 5 мин в раствор добавляют

4,69 1 г СР СООН.Н-Фен-Лей-Арг(Тос)-CH>Арг(Toc)-Д-Лей-МНС Н>, синтезированного обработкой БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-ИНС И трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,608 мл N-метилморфолина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После коно центрирования остаток растворяют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно, После концентрирования с последующим отвердеванием под действием смеси метанол/

/эфир получают 5,072 г БОК-Фен-Лей-Арг{Тос)-СН, Apr(Toc)-Д-Лей-ННС Н

Т.пл. 127-132 С (разложение).

TCX: Rf 0,66 (метанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: (а) о D

-25,4 (C=1, метанол).

Вычислено, 7.: С 56,74; Н 7,48;

Ы 14,18.

С g H 4N q О qq Ь z CH OH

Найдено, X: С 56,64; Н 7,33;

N 13,86.

Е. Синтез БОК-СНзТир(С1 Бзл)-Гли-Гли-ОН.

Растворяют в 150 мл тетрагидрофурана 9,09 r БОК-СН Тир-(С1 Бзл)ОН, (а) = -49 (C=1, этанол), синтезирован по способу С.Т.Чеунг и 2,53 r Nоксисукцинимида. После охлаждения льдом к раствору добавляют 4,12 r дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Полученные таким образом белые кристаллы отфильтровывают и к фильтрату добавляют 2,91 г Н-Гли-Гли-ОН и 38 мл водного раствора 1,848 г гидрокарбоната натрия. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 суток и затем концентрируют.

Разбавленный водный раствор лимонной кислоты и этилацетат добавляют к смеси н отделяют этилацетатный слой.

После промывки водой с последующим концентрированием продукт очищают хроматографически на колонке с силикагелем элюируемой смесью метанол/

/хлороформ = 1/30 и отверждают смесью эфир/н-гексан, получая 9,23 r БОК-СН Тир(С1 Бзл)-Гли-Гли-ОН, Т.пл,7080 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0 79 (метанол/

/уксусная кислота/хлороформ=4/ 1/12).

Оптическое вращение: (а), = -17 (С=

=1, метанол).

Вычислено, 7: С 55,54; Н 5,99;

N 6,94.

С ьНз, И О,С1 ° О БС Н ОС Н .

Найдено, Ж: С 55,45; Н 5,81;

N 6,89.

Ж. Синтез БОК-СН-Тир(С1 Бзл)-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Дз

Лей-NHC H .

Растворяют в 4 мл дкметилформамида 682 мл БОК-СНзТир(С1 Бзл)-Гли-Гли-ОН и 195 мг N-гидроксибензотриазола.

При охлаждении этого раствора льдом в него добавляют 272 мг дкциклогексилкарбодиимида. После перемешивания в течение 2 ч в раствор добавляют раствор l,167 г CF> C00H.Н-Фен-Лей-Арг (Тос) -СН Арг (Тос) -Д-Лей-КНС Н, синтезированного путем обработки

БОК-Фен-Лей-Арг(Тос) †.СН Арг(Тос)-Д3

-Лей-NHC Н трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и О, 132 мл Nметилморфолина в 8 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Образовавшийся таким образом осадок отфильтровывают, и фильтрат концентрируют и очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: метанол/хлороформ =

1/20). После отвердевания смесью метанол/эфир получают 1,391 r БОК-СН Тир-(С1 Бзл)-Гли-Гли-Фен-Лей3 2

Арг (Toc) -CH >Apr (Toc) -Д-Лей-ННС Н <.

Т.пл. 130-135 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,64 (метанол/

/хлороформ = 1/7) . Оптическое вращение: (а) = -35,3 (С=1, метанол).

Вычислено, Х: С 55,92; Н 6,77;

М 12,70.

Ст6Н щ К < О „ Бт С1 ° СН у ОН НсО

Найдено, Х: С 55,06; Н 6,49;

N 12;52.

5 143341

3, Синтез СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Apr-Д-Лей-NHC Н з

Растворяют. в 10 мл фтористого водорода в присутствии 0,2 мн анизола

5 в герметичном для HF реакционном сосуде при -5 С 220,мг БОК-СН Тир (Cl Бзл)-Гли-Гли-Фен-Лей-Apr(Тос)— СН Арг(Тос)-Д-Лей-ИНС Н . Раствор перемешивают в течение 1 ч и затем

HF отгоняют из реакционной смеси. остаток промывают эфиром и растворяк!т в воде. Раствор обрабатывают ионас бменной смолой Амберлит 1РА-93 (ук1 суснокислый тип) и высушивают вымора- )5 ванием. Полученный таким образом еочищенный пептид (120 мг) очищают етодом жидкостной хроматографии выокого разрешения (фаза Нуклеосил

С 18, диаметр колонки 2, длина

5 см, элюент 0,1 НС1 в растворе воды: ацетонитрила = 81:91)-и затем ушат вымораживанием, чтобы получить

0 мг СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН—

3 з

Арг-Д-Лей-ИНС Н .

ТСХ: значение Rf 0,70 (бутанол/ уксусная кислота/пиридин/вода

15/5/5/8).Оптическое вращение; а)„ -21,8 (С=0,4, 0,01 н. НС1). асс-спектр (ГАв) : 1036 (И+Н), Ами- д0 окислотный анализ: Гли 1,87 (2); ей 1,96 (2); Фен 1,00 (1)„ Арг

0,95 (1) (пики, соответствующие СН>

Тир- и СН Арг, не обсчитаны).

Пример 2. Синтез Тир-Д-Цис35

Гли-Фен-Цис-Арr-СН> Арг-Д-Лей-Арr-NH .

А. Растворяют в 10 мп диметилформамида 2 493 г БОК-Д-Лей-ОН Н О. РастЭ 2 вор охлаждают до -20 С и добавляют в него 1,1 мл N-метилморфолина и 40

0,96 мп этилового эфира хлоругольнои кислоты. Через 5 мин в смесь добавляют раствор 4,414 г CF>СООН.Н-Арг(Тос)"Н и 1,65 мл N-метилморфолина в 20 мл диметилформамида и смесь перемешива- 4> о ют приблизительно при -5 С в течение

2 ч. После концентрирования остаток растворяют. в этилацетате и последовательно промывают раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют эфир, чтобы вызвать затвердение продукта. Таким образом получают 4,96 r

80К-Д-Лей-Арг(Тос)-NH . Т.пл. 110—

120 С (разложение), 25

ТСХ: Rf 0,49 (метанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: (а)

*-+13,0 (C=1, метанол).

6

Вычислено, 7.: С 52,73; Н 7,50;

N i5,37.

C«HqoNe0eS Н О

Найдено, 7: С 52,77; Н 7,60;

Ы 15,14.

Б. Синтез Z-CH Арг(Тос)-Д-Лей3

Арг (Тос) -NH<.

Растворяют в 30 мп тетрагидрофурана 3,336 г Z-СНзЛрг(Тос)-ОН. Раствор о охлаждают до -20 С и добавляют в него 0,77 мл N-метилморфолина и 0,67 мл этилового эфира хлоругольной кислоты.

Через 5 мин к смеси добавляют раствор

3,882 r СР СООН Н-Д-Лей-Арг(Тос)-NH синтезированного путем обработки БОКД-Лей-Арг(Тос)-NH< трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и

1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают о приблизительно при -5 С в течение

2 ч. После концентрирования с последующим отверждением смесью метанол/

/вода получают 6,14 г Z-СНэАрг(Тос)Д-Лей-Арг(Тос)-МН. Т.пл. 100-113 С (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (меТанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: (а), = -3,4 (С=1, метанол).

Вычислено, 7.: С 54,18; Н 6 71;

N 15,04.

С„, Н„Н„, О,Б, СН OH

Найдено, 7: С 54,12; Н 6,62;

И 14,85.

В. Синтез БОК-Арг(Тос)-СН Лрг(Тос)Д-Лей-Apr(Toc)-NH .

Растворяют в 17 мп диметилформамида 4,734 г СН Арг(Тос)-Д-JIeA-Apr(Тос)—

-ИН, полученного каталитическим .восстановлением -СН Арг(Тос)-Д-Лей3

-Арг(Тос)-NH< в присутствии Pd/Ñ, 2,918 r БОК-Арг(Тос)ОН и 1,1 N-гидроксибензотриазола. К этому раствору при охлаждении льдом добавляют 1,543 г дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийся таким образом осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/

/хлороформ = 1/15) и отверждают эфиром„ получая 4,917 г БОК-Apr(Toc)—

-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Ар"(Тос)-ИН

Т.пл. 131-136 С (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлороформ — 1/7). Оптическое вращение: (а) о

37

-16, 7 (С=1, метанол) .

1433495

Вычислено, 7: С 51,32; Н 6,76;

N 16,43, С, Н И,4 О Б Н О

Найдено, 7.: С 51,15; Н 6,54;

И 16,48.

Г. Синтез БОК-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос)-CH Арг(Тос)-Д-Лей-Арг-(Тос)-ИН °

Растворяют в 4 мл диметилформамида 747 мг БОК-Цис-(СНзБзл)-OH. Раствор охлаждают до -20 С и в него добавляют 0,254 мл N-метилморфолина и

0,221 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в раствор добавляют раствор 2,497 r CF СООН Н- 15

Арг(Тос)-СН Apr(Toc)-Д-Лей-Арг(Тос)-NH, синтезированного путем обработ- ки БОК-Арг-(Тос)-СНзАрг(Тос)-Д-ЛейАрг(Тос)-ИН трифторуксусной кислотой в присутствии анизола и 0,277 мл 20

И-метилморфолина в 6 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в течение

2 ч приблизительно при -5 С. После концентрирования смесь растворяют в этилацетате и затем промывают раство- 25 ром гидрокарбоната натрия и водой последовательно. После дополнительного концентрирования продукт отверждают смесью метанола и эфира, получая

2,548 г БОК-Цис(СН Бзл)-Арг(Тос)- 30

-СН Арг(Тос) вЂ,Д-Лей-Apr(Тос)-ИН .Т.пл.

126-132 С (разложение).

ТСХ: Rf 0 51 (метанол/хлороформ =

1/7). Оптическое вращение: (а} =

= -20,6 (С=1, метанол).

Вычислено, 7: С 52,81; Н 6,82;

N 14,66.

С 4 Н р И igO iq 84 СН ОН Н еО

Найдено, 7: С 52,78; Н 6,43;

N 14,29. 40

Д. Синтез БОК-Фен-Цис(СНзБзл)-

Apr(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Toc)—

-NH Q °

Растворяют в диметилформамиде

467 мг БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают 45 до -20 С и в него добавляют О, 194 мл

N-метилморфолина и О, 168 мл этилово- го эфира хлоругольной кислоты. Через

5 мин в смесь добавляют раствор

2,234 г CF COOH Н-Фен-Цис(СНзБзл)Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)—

-NH, синтезированного путем обработки БОК-Фен-Цис (СНзБзл)-Арг (Тос)СН> Ар r (То с) -Д-Лей-Ар г (То с) -NH < трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,-211 мл N-метилморфолина в 5 мп диметилформамида, и смесь перемешивают в течение .2 ч при температуре -5 С. После конце*трирования ос-, е таток растворяют в этилацетате, и раствор промывают водным растворОм гидрокарбоната натрия и водой последовательно. После дополнительного концентрирования продукт отверждают добавкой смеси метанола и эфира, получая 2,126 r БОК-Фен-Цис(СН Бзл)Арг(Toc)-СН Apr(Тос)-Д-Лей-Apr(Тос,)о

-NH<. Т. пл. 124-130 С (разложение) .

ТСХ: значение КГ 0,56 (метанол/

/хлороформ 1/?). Оптическое вращение: (а) -- -18,9 (С=1, метанол).

Вычислено, Х: С 54-, 83; Н 6,89

И 13.,91.

С т,Н„()() И <60„4 Я 5/2CHзОН

Найдено, Х: С 54,62; Н 6,34;

N 13,64.

Е. Синтез БОК-Д-Цис-(СН Бзл)-Глиз

-ОС Н

Растворяют в 15 мл диметилформамида 3,233 r БОК-Д-Цис(СНзБзл}-ОН.Раствор охлаждают до -20 С и в него добавгяют 1,1 N-метилморфолина и

0,956 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к этому раствору добавляют раствор 1,396 г

НС1 Н-Гли-ОС Н и 1,1 мл И-метилморфолина в 20 мл диметилформамгда, и смесь перемешивают в течение 2 ч при

D температуре около -5 С. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате, и раствор промывают последовательно водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют н-гексан, чтобы вызвать затвердевание продукта.

Таким образом получают 3 6 г BOK-До

Цис-Гли-ОС Н . Т.пл. 80-82 С.

ТСХ: значение Rf О, 74 (хлороформ/

/этилацетат = 2/1). Оптическое вращение: (а) = +30,2 (С=1, метанол).

Вычислено, Х: С 58,51; Н 7,3?;

N 6,82.

Ceo Hso NGROSS

Найдено, 7.: С 58,35; H 7,23;

N 6,69.

Ж. Синтез БОК-Тир(C1 Бзл)-Д-Цис

-(СН Бзл)-Гли-ОС Н .

Растворяют 2,068 г БОК-Тир(С1 Бзл)-OH в 20 мп тетрагидрофурана. Раствор о охлаждают до -20 С и добавляют в него

0,517 мп N-метилморфолина и 0,45 и этилового эфира хлоругольной кислоты.

Через 5 мин в этот раствор добавляют раствор 1,94 г СР СООН H-Д-Цис (СН Бзл)Гли-ОС Н, синтезированного путем обработки БОК-Д-Цис(СНзБзл)-Гли-ÎC Н трифторуксусной кислотой в присутст1433415

10 вии анизола, и t мл триэтиламина в

20 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуо ре около -5 С. После концентрирования 5 к остатку добавляют воду, чтобы образовался осадок, который отфильтровывают и растворяют в смеси метанола и ороформа. После концентрирования остатку добавляют эфир, чтобы выз- «О ать затвердевание продукта. Таким бразом получают 2,661 г БОК-Тир С1 Бзл)-Д Цис(СН Бзл) Гли ОС Н -. .пл. 149-150 С, ) *

ТСХ: значение Rf 0,63 (хлороформ/ 15 этилацетат = 2/1). Оптическое вращеие: (а) = +17,0 (С=1. диметилфор-, амид).

Вычислено, %.: С 59.,01; Н 5,91;

5,73. 2О

С 36 43 Иэо1С12

Найдено, %: С 58,94; H 5,75;

5 62.

3. Синтез БОК-Тир(С1 Бзл)-Дс (СНэ Бзл) -Гли-ОН. 25

Растворяют в 30 мл тетрагидрофураа 2, 345 r БОК-Тир (С1 Бзл) -Д-Цис

СН Бзл)-Гли-ОС Н и затем добавляют з раствор 3,2 мп 1 н, раствора гидроксида натрия. Смесь перемешивают при 3О

1 комнатной температуре в течение 1 ч

Й добавляют g ней 3,2 мп 1 н. соляной

Кислоты. Полученную смесь концентри.руют. К остатку добавляют воду, чтобы продукт отвердел. Таким образом получают 1,899 г БОК-Тир(С1 Бзл)-ДЦис(СН Бзл)-Гли-ОН. Т.пл. 133-138 С

-5 (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,25 (метанол/

/хлороформ = 1/7). Оптическое вращение: (а) = +35,8 (С=1, метанол).

Вычисленор % С 57«95 у Н 5«58у

N 5,96.

С 4Н зИ От БС1

Найдено, %: С 57,81; Н 5,33;

N 5,92.

И. Синтез БОК-Тир(С1 Бзл)-Д-Цис (СН Бзл)-Гли-Фен-Цис(СН Бзл)-Арг(Тос)СН Apr(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-НН

Растворяют 983 мг БОК-Тир(С1 Бзл)Д-Цис(СН Бзл)-Гли-OH и 226 мг N-гид3 роксибензотриазола в 5 мл диметилформамида. При охлаждении льдом в раствор добавляют 316 мг дициклогексилкарбодиимица, После перемешивания течение 2 ч в этот раствор добавляют раствор 1,94 г CF>COOH.Н-.Фен-Цис

i (СН Бзл) -Apr (Тос) -СН Арг (Тос) -Д-ЛейАрг(Тос)-NH<, синтезированного путем, обработки БОК-Фен-Цис (СН > Бзл) -Арг (Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,167 мл N-метилморфолина в

10 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Полученный таким образом осадок фильтруют. После хроматографической очистки на колонке с силикагелем (элюируемой смесью метанол/хлороформ = 1/20) с последующим отверждением смесью метанол/эфир получают

2Ä0 г БОК-Тир(С1<Бзл)-Д-Цис(СН> Бзл)—

Гли-Фен-Цис(СНзБзл)-Apr(Тос)-CH Арг (Тос)-Д-Лей-Apr(Тос)-ЫН . Т.пл. 123 I30 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,63 (метанол/

/хлороформ = 1/7). Оптическое враще-. ние: (а) = -17,5 (C=i диметилформамид).

Вычислено, %; С 56,60; Н 6,52;

N i1 89.

С,«р««Н « З И «су О ««о S G Q С Н ОС Н у3 / 2 СН

Найдено, %: С 56,38; Н 6,18;

И 11«72.

К. Синтез Тир-Р,— Öèñ-Гли-Фен-ЦисАрг-СН «1рг-Д- Лей-Арг-ЫН .

Растворяют 515 мг БОК-Тир (С1 Бзл)—

-Д-Цис (СНз Бэл) -Гли-Фен-Цис (CH> Бзл)—

Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)—

-NH в 20 млфтористоводородной кислоты ь присутствии 5 мл анизола при -5 С в реакционном сосуде, герметичном для фто" ристого водорода (HF) . Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгоняют HF водорода (HF). Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгоняют HF из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и растворяют в воде.

Раствор обрабатывают смолой Амберлит

1РА-93 (уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Растворяют

320 мг высушенного продукта в 1 „3 л воды и раствор подщелачивают до рН 8 водным аммиаком. Затем в раствор вводят воздух пои перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисляют до рН 6 и. затем сушат вымораживанием.

Полученный таким образом неочищенный пептид очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент:

0,05%-ный раствор НС1 в смеси вода/

/ацетонитрил = 88/12) и сушат вымораГ нинанием, получая «АС мг гир-Л-ЛнсГпи-Фен-Лис-Арг-СНаАрг-jj-Лей-Арг-NN

Таблица !

Д Е

В С

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей3

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей3

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей5

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей3

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лейз

Арг-Арг NH

Арг-Apr- -Д-Лей-ОН

Apr-Арг-Д-Лей-ОС Н5

Apr-Арг- . -Д-Лей-ИН

Арг-Арг- -Д-Лей-NHC H

2 5

СН > Тир-Гли-Гли-Фен (пара- ИО ) -Лей-Арг-Д-Лей-NH

СН> Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-СН-Арr Àðг-Д-Лей-ИН

СН > Тир-Гли- Гли-Фен-Лей-Ар г- СН-Ар г-Д-Лей-NH

СН Тир-Гли-Гли-Фен (пара-NO ) -Лей-Арг-СН Арг-Д-Лей-NHC

СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Лиз-СН-Арг-Д-Лей-NH з й

Тир-Д-Цис-Гли-Фен-Цис-Арг-СН Арг-Д-Лей-МНС Н

13, СН> Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-Арг-Д-Лей-Ар г-NH<

СН > Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН-Ар г-Д-Лей-Ар г-NHC H <

С Д К

СН Тир-Гли-Гли-Фен-(пара-NO )-Лей-.Арг-ОН-Арг-Д-Лей-Арг-NHC H

3 2 2

СН> Тнр-Гли-Гли-Фен-Мет (О)-Apr-СНзApr-g-Лей-Арг-NH>

17

11

143

ТСХ: значение Rf 0,56 (бутанол/

/уксусная кислота/пиридин/вода =

15/5/5/8). Оптическое вращение: (а), -"29 (C=0,4, 0,01 н. НС1).

Масс-спектр (FAR): 1183 (М+Н) . Аьынокислотный анализ: Гли 1,02(1); Цис

1,83(2); Лей 1,04(1); Тир 0,80(1);

;Фен 1,00(1); Арг 2,66(2)", Цис, обусловленный СН„Арг, не рассчитывался.

Пример ы 3-29. Приведенные в табл. 1 соединения синтезированы аналогичным обычным жидкофазным способом, как в примерах 1 и 2. В этих экспериментах производные динорфина, модифицированные в положениях 1-3 (Тир-Гли-Гли), в положениях 4-7 (ФенЛей-Арг-Арг), в положениях 4-8 (ФенЛей-Арг-Илей) и в положениях 4-9

3415. 12 (Фен-Лей-Арг-Арг-Лей-Арг), синтези;рованы стадкйным способом„ исходя из

С-терминальной группы в каждом пептиде. Затем этн производные в положениях 1-3 и производные в положениях 47, 4-8 или 4-9 конценсиравали совместно по методу дициклогексилкарбодиимидов или методом смешанного ангидрида. Все защищающие группы удаляют фтористым водородом (HF), и продукт очищают методом препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя носитель обратимой фазы. В примере 13 все защищающие группы удалены HF, а соединение окислено воздухом н затем очищено методом препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения.

1433415

Продолжение табл, 1

Трет-Лей: (СН, ) ОСН(ЯН ) СООН

Гомо АРг: N Н С(КН)ННСН СН, СН СН СН(ЫН )СООН фен (пара-NO ) .ЯО / СК Б ЮЯ СООТГ

Сар: СН ИНСН СООН

В табл. 2 перечислены соединения, состав,,величины угла оптического полученные в условиях предлагаемого 15 вращения и значения Rf.. способа, с указанием аминокислотногс

Таблица 2

Аиинокислотный анализ

Фен дрг Лиэ

4Ct ТСХ

Гли Лей

197 . 1 03

-6,7

-1,0

+0,8

2,30

1,00

0,53

2 01 2,00 1 00. 1 99 0,65

1,00 1,97

0,63

1;94 1,96

Э

-7,5 0,62

1,95 1,96

1,00 1,97

+5,0

1,91 2,14

1,97 2, 00

1 93 1,91

1,92 1,95

1,99 2,00

1,97 1,99

2,18

1 00

0,64

+3,4

201

0,59

-19 ° 7

0,98

1,00

0,59

1i00

-23,.4

-16,6

0,99

0,62

0,99

0,69..12

23,3 . 0,62

1,03

1,00

1,01 1,05 . 1,00

0,70

-29,1

-7,0

1, 02

1,89 0,82

3,22

2,03 2,00 1;00

0,64

-31,0

1,94, 1,90 1,00

0,62

-27 2

-23,0

1,96 2,00

2,03

0,52

2 ° 00 . 1,00

1,00

0,46

П р и н е ч а и и е. В аиннокислотном анализе рассчитывают соотношение только аминокислот: Гли,Лей, Фен, Apr, Ала, Тир, Лиэ, Сер, Цис и Глуе. (sL) " определение: С 0,4 0,01 í. HCl. Определение эначения Rf в ТСХ: бутанол/уксусная кислота/пнрндин/вода

- 15/5/5/B.

Результаты испытаний на животных иллюстрируют эффективность соединений в качестве обезболивающих агентов.

1433415

16

Пр одолже ни е та бл . 3

15

0,7

2,0

Т а б л и ц а 4

1,0

0,44

0,8

0,32

15

1,5

0,75

0,24

3,4

4,3

3,9

3,3

4,5

2,0

0,8

3,0

0,22

Испытание 1. Испытание на обезболивание. Испытываемое соединение растворяют в физиологическом солевом растворе и вводят его внутривенно или подкожно самцам мышей линии ddy 5 (вес тела 20-27 r, при изучении обычно разбивают на группы по 8). Обезболивающую активность измеряют в испытании с ущемлением хвоста, В этом испытании ущемление хвоста .в основании хвоста, включая анальную слизистую оболочку, помещают зажим, развивающий давление около 300 г, и измеряют латентность кусания этого зажима. До эксперимента проводили отбор животных на ноцицептивность зажима хвоста, причем исключали из эксперимента тех мышей, которые не кусали зажим в пределах 3 с. В качестве критерия обезболивания применяли латентность, превышающую 6 с.

Величины ЕД д (доза, вызывающая

507. обезболивания) рассчитывают по методу Литчфилда и Уилкоксона. Ре- 25 зультаты показаны в табл. 3 (при внутривенной инъекции) и в табл. 4 (при подкожной инъекции).

Таблица 3

Динорфин (1-13) более 25,0

Испытуемое сое- Ущемление хвоста

Динение по при- ЕД, мг/кг меру (подкожно) Испытание 2. Опиоидная активность.

Опиоидные активности соединений определяют по предлагаемому способу с использованием семенного канала кролика. В этом=испытании взрослых самцов кроликов умерщвляют, вводя воздух в ушную вену. Сразу после смерти проводят лапаротомию и удаляют правый и левый семенные каналы. Семя выдавливают из каналов в раствор Ринджера.

Каждый канал нарезают на части (2,5 см длиной от конца со стороны предстательной железы). Эти кусочки семенного канала суспендируют .с помощью винта в стеклянной ячейке емкостью 6 мл при постоянной температуре и стимулируют электрическим стимулятором, имеющим платиновые электроды при следующих условиях: частота 0,1 Гц, 1млс и 90 В. Сокращение, вызванное электрическим стимулированием, записывают через преобразователь.

Опиоидную активность определяют на основании ингибирования сокращения, вызванного электрическим стимулированием.

1433415!

Таблица 5

Испытуемое соединение по примеру

Метод семенного канала кролика

ИК (наномоль) Таблица 6

Испытуемое соединение по примеру

3,5

0,04

100

1,0

6,03

0,44

Таким образом, соединения, полу20 ченные в условиях предлагаемого способа, могут быть отнесены к категории среднетоксичных и обладают более высокой анальгетической активностью, чем динорфин.

6,2

2,8

0,08

13.О, 58

2,0

6 5

Динорфин А (1-17) 17,4

Из табл. 5 очевидно, что соединения предлагаемого способа проявляют весьма большую активность по сравне- 35 нию с динорфином А. Кроме того, они имеют выс4кие активности при ингибировании сокращения илеальных продольных мьппц морской свинки и семенных каналов мьппи, вызванного электричес- <0 ким стимулированием.

Пептщ ные соединения, полученные в условиях предлагаемого способа, обладают опиоидными активностями, аналогичными активности динорфина, при- 45 чем их действие является весьма сильным, проявляются значительные обезболивающие эффекты при внутривенной инъекции или подкожной инъекции.

Очень ценно, что соединения, полу-5О ченные по предлагаемому способу про. являют сильное обезболивающее действие при систематическом введении посредством внутривенной или подкожной инъекции, в то время как динорфин и 5$ его производные обладают едва заметным обезболивающим действием при внуРезультаты представлены в табл. в единицах. концентрации 507.-ного ин гибирования (ЙКд ). тривенной инъекции, поскольку эти соединения нестабильны в крови.

Соотношение между токсичностью (минимальная летальная доза) пептидных соединений, полученных в примерах

1 и 2, и эффективной. дозой показано в табл. 6.

Ущемление Минимальная хвоста летальная

ЕД 5о, мг/KI pOss MI /KI

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

R1

ХТцй-А- Glg - — С вЂ” В -Š— Г в,"

Н вЂ” водород или один из и К< — водород, другой С,-С -алкил;

А — Gly D-Cys связанный с С, если С вЂ” Cys

 — Phe, (n-NOs)Phe;

С вЂ” Leu, Met(0), Cys, связанный с А, если А—

D Cys;

D — Arg, CH>Arg, Lys;

Š— Arg, CH>Arg;

F — NH<, D — Leu-X, где Х—

ОН, МНп, ОС Н, ИНС Н5 или D-Leu-Arg-X, где

Х-NHÄ NHC Н„ отличающийся тем, что осуществляют постепенное наращивание пептидной цепи, исходя иэ ИОС защищенной С вЂ” конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов и от полученного защищенного пептида, в случае необходимости, отшепляют, имеющиеся защитные группы.