Способ внутривидовой дифференциации штаммов стафилококков

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Цель изобретения - повышение точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков. Для осуществления способа дополнительно к Международному набору типовых диагностических бактериофагов используют три новых стафилококковых бактериофага Ф-121, Ф-122 и Ф-113. Для осуществления способа исследуемую культуру засевают на поверхность плотной среды и на газон культуры после подсушивания капельно наносят типовые фаги. По степени лизиса стафилококков проводят внутривидовую дифференцию метал- § лов стафилококков. 1 табл. СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ai (i9) SU(ii) 8ЖЗВ

tIATEHT;-,.

Е E. lG

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР.

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4253067/28-13 (22) 23.04.87 (46) 07.12.88. Бюл. 112 45 (71) Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А,Тарасевича (72) Э.А.Берилло и Л.Д. Перемитина (53) 576.8.093. 1(088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическйм методам исследования./Под ред. M.Î.Áèðãåðà.

M,: Медицина, 1982, с. 254, 118-119. (54) СПОСОБ ВНУТРИВИДОВО11 ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ (51) 4.С 12 q 1/04, 1/70//, //(С 12 Q 1/04, С 12 К 1:445) (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии. Цель изобретения — повышение точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков. Для осуществления способа дополнительно к Международному набору типовых диагностических бактериофагов используют три новых стафилококковых бактериофага Ф-121, Ф-122 и Ф-113. Для осуществления способа исследуемую культуру засевают на поверхность плотной среды и на газон культуры после подсушивания капельно наносят типовые фаги. По степени лизиса стафилококков проводят внутривидовую дифференцию метал- ж лов стафилококков. 1 табл.

1442542

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовапо при диагностике стафилококковой инфекции.

Цель изобретения — повышение точ5 ности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков.

Для осуществления способа при фаготипировании наряду с 22-я типовыми диагностическими бактериофагами используют новые штаммы бактериофагов

¹ 413, 729 и 13676.

Штаммы стафилококковых бактериофагов выделяют из лизогенных штаммов стафилококков с помощью УФ-индукции, депонированы в Государственной коллекции бактериофагов под номерами

Ф-122, Ф-121 и Ф-113 соответственно.

Фаги ¹ 413 (Ф-122) и № 729 (Ф-121) 20 формируют мутные бляшки диаметром

0,2 — 1,0 мм. Негативные колонии фага № 13676 (Ф-113) диаметром 0,5-1,0 мм имеют ясное прозрачное дно. Фаги имеют бинальный тип симметрии,т.е. отно-25 сятся к 1 типу. Фаги № 413 и 729 имеют цилиндрическую головку, фаг № 13676 — гексагональную, размером

950х950 А.

При изучении фаз взаимодействия фа- 30 гов с клеткой хозяина выявлено, что фаг ¹ 413 отличается по скорости адсорбции и латентному периоду от фагов

729 и 13676. Средний урожай на одну бактериальную клетку у фагов № 413 и 13676 низкий и составляет

5 3 и 7,8 частиц соответственно. Фаг № 729 продуцирует 69,5 частиц. Зависимости выхода фага от скорости адсорбции не отмечено. Фаги № 729 и

13676 с константой скорости адсорбции

1,6-1,7х10 млн/мин в среднем продуцируют разное количество инфекционных частиц (69,5 и 7,8).

Материалы изучения основных при" знаков бактериофагов N -413, 729 и 13676 представлены в таблице.

Антигенные свойства бактериофагов № 413, 729, 13676. Для изучения антигенных свойств бактериофагов используют антифаговые сыворотки.

Проверка антифаговых сывороток, полученных к каждому из селекционированных фагов в перекрестной реакции нейтрализации с гомологичными, гетерологичными фагами, включая фаги Международного набора различных серологических групп (А,В,Г,1), показывает, что селекционированные фаги отличаются от фагов Международной коллекции, а также между собой, причем в большей степени это можно отнести к бактериофагу N - 13676.

Антифаговые сыворотки в перекрестных реакциях нейтрализации используют в разведении, при котором наблюдается инактивация не менее 90% часо тиц гомологичного фаза при 37 С в течение 5 мин (рабочий титр).

Бактериофаги ¹ 413, 729, 13676 лиофилизированы с использованием 5% пептона, сохраняют свои свойства в течение четырех лет (срок наблюде.— ния) °

Внутривидовую дифференциацию стафилококков осуществляют при использовании коллекции фагов Международного набора, в которую дополнительно включают фаги № 413, 729 и 13676, отличающиеся специфическим литическим спектром.

Пример. Приготовление фагов для типирования, Лиофилизированные в объеме 0,1 мл бактериофаги № 413, 729 и 13676 стерильно растворяют в l мл щелочного бульона Хоттингера (рН 7,6) с 0,4% глюкозы и 0,02%. CaC1 . Из этого разведения (10 ) готовят два рабочих — 1 разведения, соответствующие 1-тестразведению (TP) и 100 TP и используют их для типирования стафилококков вместе с фагами Международной коллекции.

Подготовка штаммов для типирования, Суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в пробирку с 4,5 мл бульона Хоттингера (рН о

7,2-7,4) и выращивают 3-4 ч при 37 С (до появления заметной мути) . Одновременно готовят чашки Петри с I 2%— ным агаром, приготовленным на бульне

Хоттингера, с добавлением свежей мясной воды (рН 7,6), добавляют в него 0,4% глюкозы и 10%-ный раствор

СаС1 из расчета 0,2 мл на 100 мл расплавленного агара (перед розли- вом чашек), Чашки с агаром после застывания подсушивают 30-40 мин при о

37 С и засевают сплошным газоном 34-часовой бульонной культурой. Избыток культуры удаляют пастеровской пипеткой. Чашки подсушивают 30-40 мин при 37 С.

Проведение внутривидовой дифференциации стафилококков (фаготипирование). Дно засеянной чашки расчерчивают по 25 квадратов (по числу

413 729 13676

29 52 52А 79 80

42Е 47 53

77 83А 84

81 187

54 75

85 42Д

15 редний рохай фаа на бактериальнув клетку (частиц) Цикл

Период лизнеокапсида Констант атентый пеМорфология негатив бляшек

Хозяин Вес питатель

St.aureus фаг развискорости адсорб" ции мпн/мин иод, ин са, мин телень му ости тия, мин

Диамет ростка

120 20 140 5,3+0,62

0,5х10

2V 2ОО хбоо

IV 1200x х600

3300х10

413 67 вут

729 672 г

13676 533.

1,7х10

80 10 90 69,5к7,67

0,2-0,5

ЗЗОО 1О

1,бх10

О>5-1 0 Прозрачные IV 950х х950

55 10 65 7, 8+0,75 ззоо го

ВНИИПИ Заказ 63 у5/23 Тираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 14425 фагов: 22 фага Международной коллекции и 3 предлагаемых фага В 413, 729, 13676) и в каждый .квадрат наносят каплю соответствующего фага:

ЗА ЗС 55 71 6

Фаготипирование штаммов начинают рабочим разведением фагов (TP), Штам- 20 мы, с которыми получен отрицательный результат, на следующий день типируют повторно первым разведением фагов (разведение 10 ).

Учет результатов типирования. Степень лизиса разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме:

++++ — сливной (полный лизис); +++— полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса); ++— наличие в месте нанесения капли фага свьппе 50 колоний (первые три реакции относятся к учитываемым реакциям и регистрируются одним обозначением

"++"); + — 20 — 50 колоний фага; полное отсутствие лизиса.

В случае, если штаммы стафилокок.ка чуствительны только к дополнительным фагам, их фаговариант устанавливают с помощью последних. Например: штам Ф 5371. 1 TP 729++; У 187 1 TP

413/729/13676++ и т.д.

Применение стафилококковых бактериофагов М 413, 729, 13676 вместе с коллекцией фагов Международного набора для дифференциации 98 штаммов стафилококка, выделенных из различного материала при различных формах заболеваний, увеличивает процент дифференцируемых культур в среднем от

46,9 до 86,5Х. Использование предлагаемых селекционированных бактериофагов вместе с фагами Международного набора позволяет выявлять источник и пути передачи инфекции, вызванной новыми фаговариантами стафилококка.

Формула изобретения

Способ внутривидовой дифференциации штаммов стафилококков путем посева исследуемой культуры стафилококков на плотную питательную среду с последующим нанесением на газон культуры типовых диагностических стафилококковых бактериофагов, инкубированием посевов и учетом результатов по степени лизиса культуры, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков, дополнительно используют штаммы диагностических стафилококков бактериофагов Ф-113, Ф-1 2 1 и Ф-1 22.