Способ количественного определения аскорбиновой кислоты

 

Изобретение относится к химии водорастворимых витаминов икасается определения аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах. Целью изобретения Я1зляется упрощение способа. Способ заключается в тоМ; что к испытуемому образцуf -рН которого с помощью буферного раствора устанавливают в диапазоне 358-4 5, добавляют избыток реагента в виде 2 б-дихлорфенолиндошенола и определяют величину поглощения последнего в водной среде при 540 ни непосредственно после добавления реагента. 2 ило табл.

СОЮЗ СОБЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

ЛР1 q Сэ

ГОСУДАРСТНЕННЫИ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4134006 /28-13 (22) 09.10.86 (46) 07.1?.88. Бюл. Р 45 (71) Институт питания AMH СССР (72) Н.А.Голубкина и Е.Н.Степанова (53) 547.475.2 (088.8) (56) Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. — N.:

Медицина, 1976, с. 109-110.

Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения. — M.:

МОИП, 1984, с. 140-141. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ACKOPБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

„„SU,„, 3442932 (5И 4 G 01 N 33/02, C 12 Р 7/42 (57) Изобретение относятся к химии водорастворимых витаминов и- касается определения аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах, Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что к испытуемому образцу, .рН которого с помощью буферного раствора устанавливают в диапазоне 3,8-4,5„добавляют из.биток реагента в виде 2,6-дихлорфенолиндофенола и ойределяют величину поглощения последнего в водной среде при

540 нм непосредственно после добавления реагента, 2 ил,1 табл.

1442912 наблюдается 50 -ное разрушение в течение 10 мин.

На фиг.2 представлена зависимость степени разложения 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия от рН среды при различных интервалах времени. На практике время от момента добавления фенолята до момента колориметрирования, как правило, составляет 2-3 мин.

Интервал времени, равный 1 мин, обычно соблюдает с я редко.

Как видно из приведенных данных, при рН в области 3,8-4,5 реактив

Тилманса при выдерживании пробы в течение 2-3 мин разлагается от 0,5 до 1,5%. При рН ниже 3,8 скорость разложения фенолята значительно увеличивается, Следовательно, в выбранном интервале рН ошибка определения не превысит 1,5% при условии, если колориметрирование пробы осуществлять непосредственно после добавления реактива Тилманса.

Таким образом, существенным в предлагаемом способе является выбор рН, смещенный в более нейтральную область, при котором замедляется разложение фенолята, а аскорбиновая кислота устойчива и может быть легко дезактивирована формалином для определения редуцирующих веществ, а также выбор водной среды, улучшающий условия проведения айализа. Проведение анализа в этой среде исключает необходимость экстракции ксилолом, в результате чего отсутствует ошибка определения, связанная с неполным экстрагированием фенолята ксилолом.

Для осуществления анализа к исследуемому экстракту в З -ной метафосфорной кислоте или в 2 . †н соляной кислоте добавляют буфер, в количестве, необходимом для доведения рН до значения, входящего в выбранный интервал рН. Измеряют оптическую плотность полученного раствора после добавления избытка фенолята при 540 нм.

В качестве контрольного (кювета сравнения) используют раствор, содержащий вместо фенолята равное ему по объему количество дистиллированной воды. Содержание аскорбиновой кислоты в пробе определяют по формуле

При рН выше 4,5 разложение феноля-g5 та незначительно, а при рН 7,2 не наблюдается совсем, однако в этих условиях измерение проводить нельзя

Из-за невозможности определения редуцирующих примесей и малой устойчивос-5р ти аскорбиновой кислоты. При .рН 4,5 связывание аскорбиновой кислоты формалином становится неполным, что вносит ошибку в определение истинного содержания витамийа С. Кроме того, при рН более 7 начинает проявляться склонность аскорбиновой кислоты к окислению: при рН 7 витамин С разлагается íà 1,7 за 1 ч, при рН 8

Изобретение относится к химии водорастворимых витаминов и касается определения аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах.

Цель изобретения — упрощение способ а.

Способ заключается в следующем.

При определении аскорбиновой кислоты, предусматривающем добавление к исследуемому экстракту избытка 2,6дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ или реактив Тилманса) и измерение поглощения последнего, величину поглощения 2,6-ДХФИФ определяют в водном экстракте при рН 3,8-4,5 и длине волны 540 нм, Метод прост, имеет высокую чувст-. вительность (предел обнаружения аскорбиновой кислоты 5 MKF) позволяет . 2p сократить время анализа до 10-15 мин.

Пригоден для анализа окрашенных и неокрашенных продуктов.

Выбор условий анализа основан на исследовании стабильности 2,6-ДХФИФ 25 при различных рН. Как видно из фиг.I при рН ниже 3,8 скорость обесцвечивания реактива Тилманса возрастает, что делает метод колориметрического определения мало пригодным. 30

При рН в интервале 3,8-4,5 2,6ДХФИФ разлагается достаточно медленно, что дает воэможность осуществлять его колориметрическое определение.

При наличии редуцирующих примесей, взаимодействующих с 2,6-ДХФИФ, интервал рН 3,8-4,5 также пригоден для

1 определения аскорбиновой кислоты, поскольку в этих условиях аскорбиновую кислоту можно дезактивизировать обра- 40 боткой формалином и определить количество фенолята, прореагировавшего с редуктонами.

m(D — D<) V< 100

Х мг . = (D ) y . < (1, где D — величина поглощения. фенолята в растворителе;

1442912

D, — величина поглощения фенолята в исследуемом растворе;

D — величина поглощения феноля2 та в растворе стандарта;

m — количество аскорбиновой кислоты в пробе стандартного раствора, мг;

V — общий объем экстракта, мп;

V — объем экстракта, взятый на определение, мп;

g — навеска или объем пробы, r (мл);

100 — пересчет на 100 г (мп) продукта.

При анализе во все пробы добавляют одинаковое количество фенолята и ацетатного буфера (рН 4,5), количество растворителя в стандартном и исследуемом растворах таково, что общий объем проб одинаков.

Дпя учета редуцирующих примесей к пробе, содержащей экстракт, после добавления буфера приливают формалин в количестве, равном 1/4 полученного объема. Через 10 мин добавляют установленное количество фенолята и определяют поглощение при 540 нм против соответствующего раствора, содержащего вместо фенолята равное ему по объему количество воды. Количество аскорбиновой кислоты определяют по формуле

40 .цессе экстракции.

Ф

55 где D — величина поглощения фенолята

1 в пробе для определения редуцирующих примесей;

V — объем .пробы для определения

3 редуцирующих примесей после добавления фенолята, мп;

74 — объем остальных проб после доб авл е ни я феноля т а, мл. Пример 1: рН3,8.

10 мп витаминизированного морковного сока разбавляют 2 .-ной соляной кислотой до 100 мп, раствор фильтруют

25 мл полученного экстракта повторно разбавляют 2 -ной соляной кислотой до 100 мл.

Готовят четыре пробы:

1) 5 мл 2%-ной соляной кислоты +

5 мп ацетатного буфера, рН 4,5 (49,75 r трехводного ацетата натрия +

70 мл воды + 150 мп ледяной уксусной кислоты) + 1,5 мл фенолята (0,2 г фе-, нолята в 500 мл воды);

2) О, 5 ст андартного р аств ор а аскорбиновой кислоты (1 мкг/мл) +

+ 4,5 мп 2 -ной соляной кислоты +

5 мп ацетатного буфера + 1,5 мл фенолята;

3) 5 мл полученного экстракта +

+ 5 мл ацетатного буфера + 1,5 мл фенолята;

4) 5 мл полученного экстракта +

+ 5 мл ацетатного буфера + 2,5 мп формалина, через 10 мин добавляют 1,5 мл фенолята.

Определяют величину поглощения указанных растворов на колориметре

КФК-2 при 540 нм. В качестве растворов сравнения используют соответствующие растворы (1-4) с добавлением вместо фенолята равного объема дистиллированной воды. Содержание аскорбиновой кислоты, определенное по формуле (2)(среднее иэ двух определений), составляет 54,5 мг ..

P езультаты определения аскорбиновой кислоты колориметрическим методом > методом индофенол-ксилольной экстракции (известный способ) и прямым титрованием (общепринятыи метод анализ а) представлены в таблице.

Как видно из таблицы, метод удобен для анапиза как окрашенных, так и неокрашенных продуктов. Более высокие значения концентрации аскорбиновой кислоты, полученные колориметрическим методом, по сравнению со значениями для индофенол-ксилольной экстракции связаны с частичным удерживанием фенолята водным раствором в проПример 2.(известный). Готовят экстракт витаминизированного морковного сока в 3%-ной метафосфорной кислоте аналогично примеру 1. В 4 колбы с притертыми пробками добавляют по

5 мп ацетатного буфера, рН 4,0 (49,75 г тригидрата ацетата натрия +

+ 70 мп воды + 225 мп уксусной кислоты). В первую колбу добавляют 5 мл экстракта, во вторую 5 мп З -ной метафосфорной кислоты, в третью 0,5 мп стандартного раствора аскорбиновой кислоты (.1 мкг/мп) и 4,5 мл 3%ной метафосфорной кислоты, в четвертую 5 мл экстракта и 2,5 мл формалина. В колбы 1-3 добавляют 1,5 мп фенолята, в колбу 4 — фенолят добавляют через 10 мин.

1О

5 14429

Содержимое энергично встряхивают, приливают по 25 мп ксилола и снова встряхивают. Дают отстояться в темноте 20 мин. Измеряют оптическую плот5 ность слоя ксилола при 490 нм, Содержание аскорбиновой кислоты, определенное по формуле

Х мгу = (0 — П1 Ч 100 (в — и,) .ч, g составляет 46,3 мг%.

Пример 3. рН 4,5.

Экстракт витаминизированного морковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, используя 1,5 мл ацетатного буфера с рН

5,5 (30 г трехводного ацетата натрия +

+ 70 мл воды + 15 мл ледяной уксусной кислоты). Определяют поглощение водных растворов при 540 нм. Содержание аскорбиновой кислоты вЂ, 54,4 мг%

Пример 4. рН 3,4.

Экстракт витаминизированного мор25 ковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 1, используя по 3,5 мл ацетатного буфера с рН

4,5 (см.выше). Содержание аскорбиновой кислоты — 54,00 мг%.

Приме р 5. рН 5,0.

Экстракт витаминизированного морковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, иснользуя,по 2,0 мл ацетатного буфера с рН 5,5 (приготовление буфера по примеру 3). Содержание аскорбиновой кислоты — 53,90 мг%.

Пример 6. рН 4,2.

Экстракт витаминизированного морковного. сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, используя 10 мл буфера с рН 5,2 (100 мп

1,0 М соляной кислоты + 500 мл 1,0 М ацетата натрия + дистиллированной 45 воды до 2,5 л). Содержание аскорбиновой кислоты, определенное аналогично примеру 1, — 54,40 мг%.

Пример 7. Экстракт и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2. Как до, так и после добавления фенолята растворы остаются мутными и прямое колориметрирование невозможно (рН 3,6) .

Пример 8. К смеси, состоящей 5г

55 из 0,5 мл витаминизированного газированного напитка "Саяны" (после дегазации пробы) и 4,5 мл солянокислого буфера (пример 6:), добавляют

0,5 мл реактива Тилманса и определяют величину поглощения D используя

1 У в качестве кюветы сравнения раствор, содержащий 0,5 мл напитка, 4,5 мл буфера и 1 мл дистиллированной воды.

Аналогично определяют величину поглощения 0,5 мп реактива Тилманса в смеси, состоящей из 4,5 мл буфера и

0,5 мл дистиллированной воды (D).

Содержание аскорбиновой кислоты в мг/л напитка определяют по формуле

0 225 (D -D,) 1000

+,5 1 ) где 0,225 — коэффициент, найденный экспериментально и соответствующий величине м/(D-D ) формулы, приведенной в примере 2;

0,5 — величина пробы напитка, взятой на анализ, мл;

1000 — коэффициент, учитывающий перевод на 1 л напитка.

При сравнении определения аскорбиновой кислоты в витаминизированных газированных напитках методами колориметрического анализа и визуального титрования получено хорошее совпадение результатов, мг/л: колориметрирование 121,50; 130,39; 113,40; 128,70;

119,84; 117,60; титрование 121,98;

129 47; 113ю42; 126е26; 121„5; 113,42 соответственно.

Анализ газированных напитков не требует осуществления стадии экстракции и определения редуцирующих примесей из-за их отсутствия. Это обеспечивает существенное упрощение анализа: повышает чувствительность метода= в 2,раза (2,5 мкг по сравнению с

5 мкг), так как исключает дополнительное разведение пробы, при этом проведение анализа ускоряется приблизительно в 3 раза по сравнению с методом визуального титрования, делая реальным осуществление. автоматизации процесса.

Таким образом, как видно из примеров 1,3 и 6, колориметрический метод анализа аскорбиновой кислоты дает практически одинаковые результаты при рН в области 3,8-4,5. При рН ниже 3,8 наблюдается некоторое занижение результата .(пример 4). При рН

5,0 (пример 5) результаты также отличаются от результатов в интервале

3,8-4,5. Как видно из примера 7, условия метода индофенол-ксилольной

14429

Метод

Продукт анализ а

Колориметрический

Аскорбиновая кислота мг%

6,03

5,60

Черная смородина

460,0

Определению мешают при" родные пигменты

486,0

Витаминизированный томатный сок

94,60

89,40

94,60

Витаминизированный яблочноморковный

44,04 45,60

48,00 сок

Витаминизированный мор ковный сок

52,80

46,30

54,50 экстракции непригодны для прямого колориметрирования из-за мутности водной фазы. Пример 6 иллюстрирует также возможность использования в анализе других буферных систем. Ме-. тод индофенол-ксилольной экстракции (пример 2) сложнее предлагаемого способа и дает заниженные результаты.

Формула изобретения

Способ количественного определения аскорбиновой кислоты, предусматриваю щий приготовление испытуемого образКартофельные хлопья длительного хранения 6,20

12 8 ца, добавление к нему реагента в виде 2,6-дихлорфенолиндофенола, определение величины поглощения образца с последующим пересчетом полученных результатов по количеству восстановленного аскорбиновой кислотой реагента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, перед добавлением реагента устанавливают рН образца буферным раствором до

3,8-4,5, при этом определение величины поглощения ведут в области 540 нм непосредственно после добавления реагент а.

Индофенол- Титрования ксилольной (метод Тилэкстракции манса) (известный) 1442912

100

1ниu

2нин

9нин

4нин

98 а а

Ъ 97 Ф ц, 90 н

3 4 9 6

Фиг. 2

Сост авитель Л. Минеева

Техред Л.Сердюкова

Редактор Е,.Папп

Корректор М.Шароюи

Заказ 6378/4!

Тираж 847 Подписное

HIIHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открь тий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производст-«. пы †полиграфическ предприятие, r. Ужгород, ул. Г!роектная, 4