Питательная среда для выращивания аrтнrовастеr luтеus - продуцента рестриктазы ai и i

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО11ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ

flPH ГКНТ СССР (21) 4194876/28-13 (22) 13,02.87 (46) 07.01.89. Бюл. N - 1 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Всесоюзный научноисследовательский институт молекулярной биологии (72) Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин, Н.А.Божко, 3.А. Виестуре и М.Я.Хейслере (53) 577.15(088.8) ,(56) Авторское свидетельство СССР

В 1095642, кл. С 12 И 9/14, 1982 °

Greeh P.J., lleyneker Н.L., Bolivar F. et. а1. А generale method for

the purif сасion of restriction enzymes. — J. Nucl. Ac. Res. 1978, 5, Ф 7, р. 2373-2380.

ÄÄSUÄÄ 1449579 д1 (50 4 С 12 N 1/20, 9/14 //(C

1/20, С 12 R 1:06) (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАО(ИВАНИЯ ARTHROBACTER LUTEUS — ПРОДУ"

ЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ Alu1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается состава питательных сред для выращивания Arthrobacter luteus — продуцента рестриктаэы

Alui. Целью изобретения является повышение выхода рестриктазы Aluf u удешевление целевого продукта. Изобретение заключается в том, что питательная среда содержит в качестве источников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов в количестве 4550 г/л, что обеспечивает создание высокоэффективной. питательной среды, в которой созданы условия накопления рестриктазной активности и роста

Arthrobacter luteus. Выход рестриктазы Alu1 возрастает до 1000015000 ед/г биомассы. 2 табл.

1449579

Пример 1. Питательная среда содержит, г/л:

Белковый гидролиэат из рыбных отходов, полученных при переработке трески 50,0

Глицерин 4,0

Вода, л До 1,0

Культуру А. luteus ВКПМ-3670 предварительно адаптируют на сухом пита50

Изобретение относится к биотехнологии и касается состава питательных сред для выращивания Arthrob4.cter

lukeus — продуцента рестриктаэы Alu1.

Цель изобретения — повышение вы5 хода рестриктазы А1а1 и удешевление о целевого продукта.

Изобретение предусматривает ис.пользование белкового гидролизата„ полученного из, отходов трески (голова и внутренности). В мозгу трески со ержится 7"9% белка от свежей ткани, в сепезенках — 17-18%, почках—

16 17%, сердце — 16-18%. Кроме того, указанные отходы богаты витаминами (В :., фолиевой кислотой, парааминобе зойной кислотой, биотином), которь необходимы для нормального разви ия бактерий.

Предлагаемое техническое решение об спечивает повьш ение выхода рест иктаэы А1ы1 с 80 ед/г биомассы до

10 00-15000 ед/г биомассы.

Морфологически Arthrobacter luteus 25

gaol время развития претерпевает измене ия, т.e„ молодая культура имеет форму палочек, которые по мере обеднения среды питательными веществами и обогащения .продуктами метаболизма постепенно переходят в форму кокков.

Коккообразные клетки АгййгоЬасйег

lukeus прекращают биосинтез рестриктаэы Alu 1. Введение в питательную

1 среду белкового гидролизата из рыбных о одов способствует продлению логар мической фазы роста и предотвращает раннее старение культуры. (. рН белкового гидролизата иэ рыбнь1х отходов 7,2-7,4. При растворении его в воде рН не меняется. Оптимальным рН для Arthrobacter 1Шеиз является значение 7,2-7,4. Таким образом, отпадает необходимость при приготовлении питательной среды добавлять ьр1слоты или щелочи, которые отрицательно влияют на биосинтез рестриктазы Alu1. тельном агаре в чашках Петри при 35о

37 С в течение 16-18 ч °

Инокулят готовят, пересевая культуру бактериологической петлей в качалочные колбы (250 мл питательной среды данного состава в каждой) и размножают в условиях аэрации при

35-37 С в течение 14-16 ч. Посевной материал готовят иэ расчета 5% по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферм нтатор.

Ферментацию кулЬтуры проводят на данной питательной среде при 35-37 С, при подаче воздуха 1 объем воздуха:

;1 объем питательной среды, перемеши" вании 200-250 об/мин. Выращивают до оптической плотности суспенэии клеток 0,9-1,2 опт. ед. (ФЗК, 550 нм, кювета 0 5 см), что соответствует поздней логарифмической фазе (по калибровочной кривой).

Выход биомассы 9,0 г/л культуральной жидкости.

Выделение фермента можно проводить двумя методами.

Метод 1, 10 г биомассы бактерий .

Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (0,01 M трис-HCl рН. 7,2-7,6; 0,01 М 2-меркаптоэтанол), К 30 мл суспензии добавляют 5 мл

8%-кого раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0: 12,0, Во время разрушения клеток температуру суспензии поддерживают на уровне 1-2 С. Обрабатывают суспензию ультразвуком 5-10 с, 23 раза.

Отработанную ультразвуком микробную массу центрифугируют на центрифуге "High, speed" (10000...х g, 30 мин) .

После центрифугирования отбирают водный слой и наносят колонку с фосфоцеллюлозой (7 = 40 см ), уравновешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу

Alu1 подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение

12 ч. !

Состав диализной смеси: глицерин

50%, трис-НС1 10 мМ, рН 7,4, КС1

50 мМ, з : 144

Для определения активности рестриктазы А1и1 используют метод электрофореза в геле.

За единицу активности рестриктазы

Alu1 принимают количество фермента, достаточное, для полного расщепления

1 мкг ДНК фага за 1 ч при 37 С.

Выход рестриктазы Alu 150000 ед/

/10 мл, активность 15000 ед/мл, выход

15000 ед/г биомассы.

Метод 2. Размороженную биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

В-3670 (50 г) суспендируют в 100 мл

10 мМ трис-НС1 буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ азид натрия, 1 мМ трилон Б (буфер А) и доводят этим же буфером до объема

150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл

10Х-ного тритона Х-100 и 150 мг ливоцима. Лизис проводят 1 ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лиэат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл 15Х-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл ЗОХ-ного .водного раствора полиэтиленгликоля и 35 мл 4,0 N хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге "FIigh

speed" (20000 х g, 20 мин) . Верхнюю

ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двукратным объемом буфера А, добавляют тритон Х-100 (О, 1X) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим О, 1Х-ный тритон Х-100 (буфер Б). Фермент элюируют 0-1 0 N линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере

Б. Фракции, содержащие рестриктаэу

Alu1 концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55Х-ный глицерин.

Выход рестриктазы Alui 525000/

/50 мл, активность 10500 ед/мл, выход рестриктазы Alui 10500 ед/г биомассы;

По данным электрофореза препарат фермента не содержит детектируемых примесей неспецифических эндонуклеаз.

Пример 2. Питательная среда содержит, г/л;

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески 47,5

9579

52,5

4,5

До 1,0

Выращивание биомассы. Адаптацию

55 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1, Выход биомассы 3,5 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Alu1, Глицерин 3,5 оо

Вода, л Доt 0

Выращивание биомассы. Адаптацию

5 культуры инокуляцию посевного матеУ риала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 8,0 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Alu1

12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л культуральной жидкости, Пример 3. Питательная среда содержит, г/л:

Белковый гидролизат из рыбных ченных при переработке трески 45,0

Глицерин 3,0

Вода, л До 1,0

Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1 °

Выход биомассы 7,0 г/л культураль25 ной жидкости, выход рестриктазы Alu 1

10000 ед/л биомассы, 700000 ед/л культуральной жидкости.

Пример 4.(иллюстрирует запредельные значения параметров). Питательная среда содержит, г/л:

Белковый гидролизат из рыбных отходов, получаемых при переработке трески 45,5

Глицерин 2,5

Вода, л

До 1,0

Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,0 г/л культуральной жидкости, выход,.рестриктазы Aqui

5500 ед/г биомассы, 16500 ед/л куль" туральной жидкости.

Пример 5 (иллюстрирует запре-

45 дельные значения параметров). Питательная среда содержит, г/л .

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески

Глицерин

Вода, л

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески

20 Глицерин

Вода, л

45 0-50 0

3,0-4,0

До 1,0

Таблица1

Выход рестриктазы

Питательная среда, Выход биомассы, г/л ед/л культураль ной жидкости

Шта м-продуцент ед/г био- ед/л куль массы туральной жидкости

Белковый гидроли зат из рыбных отходов 45,0-50,0

Artlhrobacter luгепз ВКПИ В-3670

10000- 7000015000 135000

7000-8000 2800040000

7, 0-9,0

Artlhrobacter luteus ВКПБ В-18l0

Глицерин 3,0-4,0

Вода, до 1,0 л

4,0-5,0

ЛгфгоЬасгег lutegs ВКПМ. В-1777

3000-4000 1200020000

4,0-5 0

Т а б л и ц а 2

Питательная среда

Штамм-продуцент

Выход биомассы, ед/л культуральной жидкости. Выход рестриктазы ед/г био- ед/л культумассы ральной жидкости

Aithrobacter lu- Триптон 11,0 г/л

teus BKIIN В-3670 дрожжевой экстракт 22,5 г/л 3,75-4,5

Arthrobacter lu- 1И К НР0., 51 мл, teus ВКПИ В-1810 1И КН РО 15,7 мл 2,0-2,5

Arthrobacter lu- Глицерин 4,0 мл, teus ВКПИ В-1777 Вода до 1,0 л 2,0-2,5 1500-2000 3000-5000

6300-7500 23625-33750

4000-5000 8000-12500

ВНИИПИ Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r Ужгород, ул. Проектная, 4

14

5000 ед/г биомассы, 17500 ед/л культуральной жидкости.

Данные выращивания штаммов — продуцентов рестриктазы А1и1 на .предлагаеМой питательной среде приведены в твбл. 1. бранные выращивания штаммов — продуц нтов рестриктазы Alu1 на известной питательной среде приведены в таб . 2.

3 табл. 1 и 2 видно, что при выращ ванин различных штаммов — продуцен ов рестриктазы Alu1 на предлагаемой питательной среде происходит увелич ние выхода . биомассы и рестриктаз i по сравнению с результатами, получ иными с использованием известной сре ы.

Ф о р м у л а изобретения итательная среда для выращивания

Art robacter 1uteus — продуцента ре49579 6 стриктазы Alu1 содержащая н качест-, ве источника углерода глицерин, источники аминного азота, витаминов, микроэлементов и воду, о т л и ч а— ю щ а я с я тем, что, с целью повышения выхода рестриктазы Л1ц1 и удешевления целевого продукта, в пита-. тельную среду вводят в качестве ис1р точников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески, при следующем соотношении компонентов, г/л среды: l5