Способ получения исходного селекционного материала сахарной свеклы

 

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве. Цель изобретения - снижение трудоемкости, расширение генофонда фертильной свеклы и повышение выхода особей на фертильной основе. Из гомогенизированных тканей корнеплодов сахарной свеклы выделяют ДНК митохондрий, которую гидролизуют с помощью фермента и подвергают электрофорезу. Полученные рестриктные спектры ДНК сравнивают со стандартным спектром исходной популяции. На основании сравнения отбирают корнеплоды с мутацией цитоплазмы. Для анализа выделяют ДНК из закрепителей стерильности ЦМС-форм. 1 3. п. ф-лы, 2 ил. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК дц 4 А 01 Н 1 04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВтОРСК0М СвиДВТЕПьСтвМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4157844/30-13 (22) 08.12.86 (46) 15.03.89. Бюл. № 10 (71) Институт ботаники им. Н. Г. Холодного (72) И. К. Комарницкий, А. М. Самойлов, Ю. Ю. Глеба и В. Г. Перетятько (53) 631.521 (088.8) (56) Quetier F. Udel F. Hetегоgeneous population of mitohondrial DNA moleeuIes in

higher plants.— Nature, 1977, v. 268, р. 365—

368.

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Цель изобретения — снижение трудоемкости, расширение генофонда фертильной свеклы и повышение выхода особей на фертильной основе.

На фиг. 1 представлены схемы спектров митохондриальной ДНК корнеплодов сахарной свеклы фертильной линии ИМ; на фиг. 2 — схемы спектров в сравнении корнеплода сахарной свеклы опылителя О-типа

БУО-1 и сахарной свеклы со стандартной цитоплазмой БУО N-2.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут корнеплоды исходной популяции фертильной сахарной свеклы, Количество корнеплодов в пробе для отбора одного источника новой цитоплазмы в зависимости от исходной популяции может составлять до 150 шт. В каждом корнеплоде определяют

„„ЯО„, 1464971 А 1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (5?) Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве. Цель изобретения — снижение трудоемкости, расширение генофонда фертильной свеклы и повышение выхода особей на фертильной основе. Из гомогенизированных тканей корнеплодов сахарной свеклы выделяют ДНК митохондрий, которую гидролизуют с помощью фермента и подвергают электрофорезу. Полученные рестриктные спектры ДНК сравнивают со стандартным спектром исходной популяции. На основании сравнения отбирают корнеплоды с мутацией цитоплазмы. Для анализа выделяют ДНК из закрепителей стерильности LIMC-форм. ! з. п. ф-лы, 2 ил.

- особенности генов цитоплазмы. Для определения этих особенностей используют метод рестриктного анализа митохондриальной

ДНК, причем из гомогенизированных тканей корнеплодов сахарной свеклы выделяют

ДНК митохондрий, которую гидролизуют с помощью фермента, подвергают электрофорезу, гель-электрофорез фотографируют в ультрафиолетовом свете. Полученные рестриктные спектры ДНК сравнивают со стан дартным спектром исходной популяции. На основании такого сравнения отбирают корнеплоды с мутацией цитоплазмы, которые идентифицируют между собой.

Для повышения выхода корнеплодовмутантов, отличающихся по цитоплазме, отбор их ведут среди опылителей О-типа.

Положительный эффект предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет расширить генофонд и направленно вовлечь в селекционный процесс растения с разной цитоплазмой для создания линий и гибридов

146497! фертильной сахарной свеклы с новыми свойствами, определяемыми генетическими различиями цитоплазмы.

Отбор мутантов среди опылителей О-типа дает возможность повысить вероятность встречи с растениями, отличающимися цйтоплазмой, и, следовательно, сократить (в пределах до 150 раз) затраты времени, труда и средств на отбор каждого источника новой цитоплазмы по сравнению с отбором его из о ычной популяции культуры свеклы.

Пример, В качестве исходных популяций с харной свеклы взяли фертильные линии —

1 вановская многосемянная (ИМ) и сорт

Б, лоцерковская односемянная (БЦО) . Кром1г того, испытанию подвергли корнеплоды сахарной свеклы — опылителей О-типа (закрепителей стерильности), сорта Белоцерковская односемянная (БЦО)., линий Иван(нская;дносемянная (ИО 1! 7, ИО 194, II0 3)(4;"Ц 83), Ялтушковская односемяннЬя (ЯО 4128, ЯО 4130) и др.

В указанных корнеплодах фертильной с4харной свеклы определили биохимические особенности генов цитоплазмы, для чего ис пользовали рестриктный метод анализа м(тохопдриальной ДНК. Ткани корнеплодов (По 50 г) гомогенизировали в буфере (А), содержащем 50 мМ трис; 3 мМ ЭДТА.;

330 мМ сорбита; 0,1 (, В А; 0,01 мМ меркаптоэта нол а; р Н 8,0.

Затем выделили из гомогенизированных тканей корнеплодов митохондрии. Массу о жали через фильтр. Гомогенат центрифуг ровали при 3200 об/мин и температуре

0:С в течение !О мин. Супгрнатаит повторно цдитрифугировали при 10000 об/мин и температуре 0 С в течение 15 мин, Осадок митохондрий суспендировали в

10 мл буфера (А). Митохондрии обработали

ДНКазой для удаления примесей ядерной и хлоропластной ДНК,. К суспендированному осадку добавили 10 мМ МдС4 и 250 мкг

ДНКазы. Гидролиз провели при температуре

0 C в течение 30 мин.

Действие фермента прекратили путем добавления 3-кратного обьема буфера (Б), содержащего 25 мМ ЭДТА; 0,6 мМ сахарозы;

50 мМ трис — HCI; рН 8,0.

После этого митохондрии осадили путем цонтрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 мин. Осадок митохондрий суспендировали в 10 мл буфера (Б).

Затем суспендированный осадок наслоили на ступенчатый градиент сахарозы: 45, 36 и ЗОО -ной сахарозы соответственно по 5, 10 и 10 мл.

Градиент сахарозы с наслоенным осадком митохондрий центрифугировали при

20000 об/мин и температуре 4 С в течение

1 ч. Очищенные митохондрии собрали в слое между 45 и 36О-ной сахарозой.

ДЙК из очищенных митохондрий выделили следующим образом. В митохондрии

1О

i5

S5 добавили 1 мл раствора проназы концентрацией 6 мг/мл и суспендировали их. Затем добавили 1,2 мл 1ОЯ-ного раствора лаурилсаркозилата натрия, перемешивая, довели объем смеси до 6 мл буфером, содержащим

50 мМ тряс, 20 мМ ЭДТА, рН 8,0. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. В полученный лизат влили

2 мл 4 М хлористого цезия. После этого лизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин.

К надосадочной жидкости добавили 3,2 г сухого хлористого цезия, 100 мкл раствора бромистого этидия концентрацией 10 мг/мл и подслоили 3 мл 6 М раствора хлористого цезия.

Градиент центрифугировали при

25000 об/мин в течение 12 ч.

Слой митохондрий отобрали в ультрафиолетовом свете, развели в три раза водой и центрифугировали при 35000 об/мин в течение 3 ч.

Полученный осадок ДНК растворили в

100 мкл воды, добавили к раствору 2-кратный объем этанола и центрифугировали при

15000 об/мин в течение 1 мин.

Осадок ДНК промыли 2 раза 70Я-ным этанолом, вы ушили и растворили в 100 мкл воды.

Гидролиз ДНК провели с помощью фермент" 8am Hl в 50 мкл реакционной среды, содержащей 10 мМ трис HCI, рН 7,6; 60 мМ

NaC1, 10 мМ Ng804, 1 мМ меркаптоэтанола и ? мкг митохондриальной ДНК.

После инкубации длительностью 3 ч при температуре 37 С фрагменты подвергли электрофорезу в 0,8g -ном агарозном геле в течение 16 ч.

Гель-электрофорез ДНК митохондрий фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Таким образом, получили рестриктный спектр митохондриальной ДНК по каждому корнеплоду отобранных для исследования растений сахарной свеклы.

Рестриктные спектры митохондриальной

3НК корнеплодов опылителей О-типа сравнили с тождественными между собой спектрами стандартной цитоплазмы исходных популяций, из которых получен тот или иной опылитель. В результате сравнения установили, что сорт БЦО со стандартной цитоплазмой отличается от всех других изученных популяций фертильной сахарной свеклы, стандартная цитоплазма которых выше, тождественна.

На основании сравнения установили закономерность, которая находит выражение в том, что каждый опылитель О-типа является мутантом по цитоплазме в отношении к исходной популяции, на основе которой он создан.

Как видно из материалов, представленных на фиг. 2, спектр митохондриальной

ДНК опылителя О-типа БЦО (фиг. 2.1) от1464971

Формула изобретения

2 личается от спектра цитоплазмы исходной популяции (фиг. 2.2) наличием в нем фрагметов ДНК вЂ” 1 — 7, 13, отсутствующих в смежном (контрольном) спектре, который, с другой стороны, имеет свои отличительные фрагменты ДНК вЂ” 1 — 5, 7, 12, 14.

По сравнению с отбором фертильных растений-мутантов из исходных популяций сахарной свеклы по известному способу выход источников новой цитоплазмы увеличивается многократно, поскольку каждый опылитель О-типа является мутантом по цитоплазме в отношении популяции, на основе которой он создан.

Предлагаемый способ позволяет выявлять, отбирать и идентифицировать на генетической основе фертильные растения сахарной свеклы как среди ее популяций, так и среди опылителей О-типа.

1. Способ получения исходного селекционного материала сахарной свеклы, включающий отбор из популяции растений с модифицированной цитоплазмой, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости, расширения генофонда фертильной свеклы и выхода особей на фертильной основе, отбор растений с модифицированной цитоплазмой ведут среди закрепителей стерильности

ЦМС-форм.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что модификацию цитоплазмы определяют методом рестриктного анализа митохондриальной ДНК корнеплодов.

1464971

2

Ц

5

8

Составитель Е. Шкрадюк

Редактор М. Петрова Техред И. Верес Корректор Л. Пилипенко

Заказ 849/4 Тираж 618 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР ! 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат «Г1атент», г. Ужгород, ул. Гагарина, 101