Способ определения поверхностного давления биологических мембран

 

Изобретение относится к области молекулйрной биологии и может быть использовано для изучения поверхностного давления (Пд,) различных клеточных мембран и регистрации изменений в них. Цель - повышение точности спо-- соба. Определяют Пд, при которых происходит разрушение монослоев поверхностно-активных веществ (ПАВ), и площади , занимаемые их молекулами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Выбирают два ПАВ с одинаковой площадью молекул, но с разным П,., при этом первое вещество обладает большим Ид,, и определяют биологическую активность выбранных соединений. Расчет величины П„ проводят по формуле с использованием величин П, при которых происходит разрушение монослоев (П и П), и отношения биологическ}1х активностей ПАВ (А, и А) при их действии на мембраны. а $

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1465768 А1 (51)4 С 01 N 33/483

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

П 1п(А.. /А ) при

Пт при А /А птп%

П-П .т 2 — --ln (А/A) т

П, Гни А /А, yexp ()

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4146090/28-14 (22) 23. 06. 86 (46) 15.03.89. Бюл. К 10 (71} Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) С .Н.Семенов и Н.И.Королев (53) 612.012(088.8)

1 (56) Biochim et Biophys. Acta, 1975, v. 406, У 1, P. 97-107. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ДАВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН (57) Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для изучения поверхностного давления (rr„) различных клеточных мембран и регистрации изменений

Изобретение относится к молекуляр-" ной биологии и может быть использовано для изучения поверхностного давления различных клеточных мембран и регистрации изменений, происходящих в последних.

Цель изобретения — повышение точности способа и обеспечение возможности определения поверхностного давления различных биологических мем-.: брак ..

Определяют поверхностное давление биологических мембран, при котором в них. Цель — повышение точности способа. Определяют П, при которых происходит разрушение монослоев поверхностно-активных веществ (ПАВ), и площади, занимаемые их молекулами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Выбирают два ПАВ с одинаковой площадью молекул, но с разным П,„, при этом первое вещество обладает большим П„, и определяют биологическую активность выбранных соединений.

Расчет величины П„проводят по формуле с использованием величин П, при которых происходит разрушение монослоев (П„и П ), и отношения биологических активностей ПАВ (А„и А ) при ф их действии на мембраны.

1,2 происходит разрушение монослоев поверхностно-активных веществ (ПАВ), и площади, занимаемой одной их молеку- )4 лой на границе раздела полярной и Cb неполярной фаз. Из них выбирают два, Щ .. поверхностно-активных вещества с оди- и,Д иаковой площадью молекул, но с различным поверхностным давлением. При ОО этом первое вещество должно обладать большим поверхностным давлением. Из меряют любым известным способом их биологическую активность и поверхностное давление биологических мембран определяют по формуле

П, А

3о (А

П, А, exp (n,/n ) з 1465768 где А — биологическая активность . занных параметров производят известгде первого поверхностно-актив- ными способами, р р, б нап име по сжатию ного вещества; монослоев поверхностно-активных веА — б on гическая активность ществ, нанесенных на границу разде2. и о

5 второго поверхностно-актив- ла фаз вод ду а-воз х с использованием ного вещества; метода Вильгельма. Затем выбирают

П - поверхностное давле да ление при два поверхностно-активных вещества

1 котором разрушается моно- с одинаковой площ д а ью молекул но с слои первого п о поверхностно- 10 разным поверхностным давлением. При активного вещества, с ормисформи- этом первое вещество должно обладать большим поверхностным давлением. Дарованный на границе раздела полярно и п и не олярной лее определяют биологическую актив° ность выбранных соединений, которую фаз; ю о ноII — поверхностное д авление при 15 можно определить по изменени д ь котором разруш . о ом азруша.ется моно- го из множества параметров, описывавших функционирование биологичесактивного вещества, с сформи-. ких мембран с помощью различных изУ рованный на границе раздела вестных способов. полярной и неполярнои Фаз; Так биологическую активность выб-!

П вЂ” поверхностное давление иоб — ранных поверхностно-активных веществ м можно определять по лизису клеток, логической мембраны.

Использование двух пове верхностно- который измеряется различными изх ве еств с одинаковой пло- вестными способами, например, как в активных веществ с о егист ации (спектрогранице вода-мембрана, т.е. 25 прототипе,.по регистр щадью на гр

: выхо à геэти поверхностно-акти вные вещества фотометрически) скорости: д обладают родственным химическим стро- моглобина из эритроцитов при наруением, а следовательно, аналогичным шенин целостно сти их мембран. Биоломолекулярным механизмом деиствия на гическу ю активность поверхностно-акбиологические мембраны, позволяет О тивных веществ можно также опредеприменять эти соединения для опреде- ля ять по ско ости или степени изменер о авления раз- ния активности мембранных ферментов, ления поверхностного давления личных иомем ран б б ан (клеток эукариотов, которые регистрируются различными .ирусов и . . нап име по ! б .ирусов и т.д.) известными способами, например, прокариотов, оболочек вирусов и ( э ит о тов набуханию митохондрий или по скороса Не только мембран эритроцитов 35 н

) ти поглощения ими О, или по опреде(лр ототип) . ос. — к н ент а и поверхВ качестве поверх ос. ностно-активных лению отношения ко ц р ци" б - ностно-активных веществ, вызывавших веществ используют различные мем раб ада щие одинаковый биологический эффект, нано-активные соединения, о ладающие п имер путем определения концентраодинаковой площадью на границе p as 40 p y ций поверхностно-активных веществ, дела фаэ непосредственно действуюнеобходимых для подавления роста микщих на мембрану агентов, но с различным поверхностным давлением, при роорганизмов.

Расчет величины поверхностного котором разрушаются их монослои на бан(П) ной и неполяр- давления биологических мембран ()

rpaHHue pasadena nonnp o e „5 ной фаэ. Такими поверхностно-актив- осуществляется с использованием в— личин поверхностного давления, при ными веществами могут быть мыла и котором происходит разрушение монодетергенты, антибиотики, компоненты об- слоев (П и П ), и отношения иолоб различных ядов (например пчелы, ко—

А) ры и др. и прочие соединени ди ения удов- гических активностей (А „

50 вер хност но-активных в еществ при их во яю е уклзанным требованиям. ействии на мембраны по приведенным

Способ осуществляется следующим деиствии н формулам. образом.

П и м е р 1. В качестве поверхОпределяют поверхностные давления, Пример . к ностно-активных веществ используют при которых происходит paspyme e 55 !!, !! е- г ами ин S u его "полностью L монослоев поверхностно-активных ве- р цид еств, и площади, за нимаемые их мо- аналог, которые при воздействии на

Щ ° мембраны образуют комплексы с их лекулами на границ р д е as ела полярнои

Эти комплексы на пои неполярнои фаз. п

" ф О ределение ука- фосфолипидами. ти к

5 146 5 верхности раздела фаз воздух-0,001 М .раствор КС1 образуют монослои, которые разрушаются при поверхностном давлении 34,5 дин/см для грамициди5 на S и 9,0 дин/см для его аналога.

Площади комплексов для грамицидина S и "полностью L грамицидина S равны, соответственно, 145 А < и 145-150 А, т.е. эти комплексы имеют одинаковую площадь на границе раздела полярной и неполярной фаз (поверхностное давление регистрируют по методу Вильгельма). В опытах для определения поверхностного давления биологических мембран берут в двух пробирках суспензию митохондрий печени крыс с одинаковой концентрацией (например

0,5 мг белка/мл), рН 7,3-7,4. В одну пробирку добавляют метональный раствор грамицидина S а в другую — метанольный раствор "полностью L" грамицидина S в количествах, необходи мых для того, чтобы получить одинаковую концентрацию этих соединений 2б (например 20 нМ на мг белка митохондрий). Затем через определенное время (например, через 1 мин после перемешивания) определяют скорость дыхания митохондрий по поглощению Зр кислорода в амперометрической ячейке типа Кларка. Установлено, что скорость дыхания в первой пробирке в

10 раз больше. Отношение биологических активностей (А,/А ) равно 10, а ехр (П,/П ) = ехр(34,5/9,0)=45. Следовательно, выполняется условие, указанное в первом варианте. Тогда поверхностное давление мембран митохондрий

П„=П 1п А,/А =9,0 1п10=21,Один/см.

Пример 2. В качестве поверхностно-активных соединений используют те же вещества, что и в примере 1.

В опытах для определения поверхностного давления биологических мембран берут в двух пробирках суспензию эритроцитов человека с одинаковой концентрацией (например, 10 клеД ток/мл) . В одну пробирку добавляют метанольный раствор грамицидина S, в другую — метанольный раствор "нолностью L" грамицидина S в количествах, чтобы получить одинаковую конечную концентрацию этих соединений, например 0,1 мИ. Затем регистрируют скорость лизиса эритроцитов по способу, указанному в прототипе. Устзновлено, что скорость лизиса эритроцитов в первой пробирке в 45 раз больше. Отношение биологических активностей (А,А ) равно 45, à ехр (П,П ) = ехр (34,5/9,0) = 45. Следовательно, выполняется условие, указанное во втором варианте ° Тогда поверхностное давление мембран эритроцитов человека

П „„= П„= 34>5 дин/см.

Пример.3. В качестве поверхностно-активных веществ используют те же соединения, что и в примере 1.

В опытах используют Staphylococcus

aureus в среде, которая на 1 л содержит 10 r глюкозы, 5 r NaC1, 5 г пептона, 30 мл бульона Хоттингера, рН 7,0-7,2, и определяют антимикробную активность поверхностно-активных веществ способом серийных разведений.

Грамицидин подавляет рост микроорганизмов при конечной концентрации

Е /мл, а его аналог — 60-70 /мл. Отношение биологических активностей (А,/А ) равно 60-70, а ехр (П,/П )

= ехр (34,5/9,0) = 45. Следовательно, выполняется условие, указанное в третьем варианте. Тогда поверхностное давление мембран

П,П А., П = — — 1п(-)= 55 < 5 дин/см. П-П А

1 2 1

Использование предлагаемого способа позволяет более точно, по сравнению с прототипом, определить поверхностное давление различных биологических мембран с помощью двух, заранее отобранных поверхностно-активных веществ. По прототипу поверхностное давление мембран эритроцитов человека лежит в диапазоне 31-35 дин/см, определенное по предлагаемому 34,5

«+0,3 дин/см.

Формула из о бр ет ения

Способ определения поверхностного давления биологических мембран путем обработки биологических мембран поверхностно-активными веществами, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа и обеспечения возможности определения поверхностного давления различных биологических мембран, определяют поверхностные давления, при которых происходит разрушение монослоев по7 14б 5768 8 верхностно-активных веществ, и пло- ным поверхностным давлением, при этом щади, занимаемые одной их молекулой первое вещество обладает большим давна границе раздела полярной и непо- лением, измеряют их биологическую лярной фаз, иэ них выбирают два по- активность,а поверхностное давление верхностно-активных вещества с оди- П 1 биологических мембран определяют

5 каковой площадью молекул, но с раз- по формуле

А

П71п (A„/À ) при А,/А (ехр (П,/П ); А — = 1; l ехр (П„/Пг) Составитель А. Агуреев

Редактор И. Касарда Техред Л.Олийнык

Корректор М. Пожо

Заказ 938/44 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбина "Патент ", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101 где П и ! (! !

П при А /А = ехр (П,/П );

П,П, П„-П ъ

1п (А /A ) при A /Ак)

1 2

П - поверхностное давление, 1 при котором разрушается монослой соответственно второго и первого веществ, сформированный на границе раздела полярной и неполярной фаз, А,: и А — биологическая актив1 ность соответственно первого и второго веществ.