Способ получения внеклеточной инвертазы из дрожжей

 

Изобретение позволяет получать фермент из фильтрата культуральной жидкости пекарских дрожжей. С целью повышения выхода целевого продукта в среду культивирования в процессе выращивания дрожжей в начале и в конце логариф- fAwecKoR фазы роаа проводят обработку культурапьной жцдкэаи в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме до аепени разрушения клеток не более 15-20 мас.%. 1 ид

IWl (19) SU (11) 1474559 Al (51) 5 С 12%9 26

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ IIATEHTBOE

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) " . " 4ЙЖфя

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4183269/13 (22) 19.M.87 .

{46) 30.1193 Бюл. Ив 43-44 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР

P2) Ушаков В.М„ Циоменко АБ„Лупааин B.В„Кулаев И;С„Фихте БА (54) СГИЖОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ

ИНВЕРТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ (57) Изобретение позволяет получать фермент из фильтрата культуральной . жидкости пекарских дрожжей. С целью повышения выхода целевого продукта в среду культивирования в процессе выращивания дрожжей в начале и в конце логарифмической фазы роста проводят обработку культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме до степени разрушения клеток не более 15- 20 мас%. 1 ил.

147155>9

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в кондитерской промышленности для приготовления некристаллиэуемых начинок, в производстве безалкогольных напитков и как биохимический препарат.

Пель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Способ заключается в том, что дрожжи культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота, до начала логарифмической фазы роста, проводят обработки в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме. продолжают культивирование до конца логарифмической фазы роста, повторяют дезинтеграцию и культивируют дрожжи до максимального накопления инвертазы в среде, Обработка культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме не приводит к нарушению (или временной остановке) процесса культивирования, В момент дезинтеграции происходит разрушение части клеток не более 15-20 мас,$, которые через 2-3 ч культивирования не обнаруживаются, Содер>кимое разрушенных клеток выходит в среду, за счет чего, вероятно, может интенсифицироваться как рост культуры, так и синтез ферментов, в том числе и инвертазы.

Остальные клетки в популяции сохраняют свою жизнеспособность, чем и обьясняется отсутствие нарушения роста культуры. Однако, как показывает электронная микроскопия, клеточная стенка этих клеток видоизменяется, что, по-видимому, и обуславливает нарушение связи инвертазы с клеткой и выход основной ее массы в среду в процессе дальнейшего культивирования.

Если в момент дезинтеграции разрушается более 207 клеток процесс проходит также с выходом инвертазы в среду, Но увеличивается его длительность, Обработка культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе может быть проведена и в другие моменть, логарифмической фазы роста культуры, но осуществление ее предлагаемым способом (в начале и в конце логарифмической фазы роста) обеспечивает наилучшие результаты как по выходу инвертазы, так и по длительности процесса, Проведение дезинтеграции во время стационарной фазы нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему увеличению содержания инвертаэы в среде (cM, чертеж).

Пример 1. Дрожжи Saccharomyces

cerevilae T-32 выращивают в 10-литровом ферментере (АК-10) с 5 л среды, содержащей, г/гк пептон 20, сахароза (техн.}30. В качестве инокулята используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80/, насыщения 02; 800 об/мин, рН 5,8.

В процессе ферментации в начале логарифмической фазы роста дрожжей проводят обработку всего содержимого ферментера в баллистическом дезинтеграторе ФУГ-1 в течение 2 мин. Дезинтеграцию (обработку) проводят в импульсно-рециркуляционном режиме в течение 2 мин. скорость вращения ротора 1500 об/мин, абразивный материал — дивинилбензолстирол (микрошарики диаметром 200 — 300 мкм) в количестве 100 мл

15 насыпного объема. Получающийся при этом нативный дезинтеграт с процентом разрушенных клеток не более 15-20 мас. /, от общей биомассы подают в ферментер, Через 2-3 ч роста в ферментере не обнаруживают разрушенных клеток.

Накопление секретируемой инвартазы после обработки с помощью баллистического деэинтегратора ФУГ-1 резко увеличивается s среде роста (см.чертеж).

8 конце логарифмической фазы роста вышеописанную процедуру повторяют.

Процесс культивирования продолжают до наступления стационарной фазы роста (40 ч). Максимальная активность инвертазы в

30 среде к этому моменту составляет 26,5

Е/мл, удельная активность 13,2 Е lмг белка.

Контроль, Осуществля>от, как описано в примере, но культивирование проводят по известному способу, т.е. без обработки"

35 культуральной жидкости в процессе культивирования в баллистическом деэинтеграторе в рециркуляционном режиме.

Ыаксимальная активность инвертазы в среде составляет 4,6 Е/мл. Большая часть ин40 вертазы остается связанной с клеткой (37,4

Е/мл), для ее извлечения необходимо разрушение клеток, при этом удельная активность в получаемом дезинтеграте составляет 2,05 Е/мг белка.

45 Пример 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1. íî в качестве штаммапродуцента используют дрожжи

Saccharornyces cerevtsiae 0-15(303-67 АТСС

26524), Процесс культивирования продол50 жают до наступления стационарной фазы роста (30 ч), Максимальная активность инвертаэы в среде к этому моменту 3,6 Е/мл, удельная активность 4,7 Е/мг белка.

Пример 3. Способ осуществляют, как

55 описано в примере 1. но в качестве штаммапродуцентра используют Saccharornyces

terres tris 0-28, который выращивают в 100литровом ферментере с 70 и среди, содержащей. г/л: пептон 20, сахароза (техн.) 20. В качестве инокулята используют суточную

1471559 лэ изоgpeтeния 30 инвеР азы, о лича Q йсЯ е, ч.о, Формула изо целью повышения выхода целевого проСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ BHEKflETO×- дукта, в процессе культивирования в начаHQA ИНВЕРТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ, вклю-: ле и в конце логарифмической фазы роста чающий культивирование продуцирующего культуральную жидкость обрабатывают а микроорганизма на питательной среде со 35 баллистическом деэинтеграторе в рециркудержащей источники углерода, азота и во- ляционном режиме до достижения степени ду, до максимального накопления .разрушенияклетокнеболее15-20мас. . культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80-90 насыщения 02; 800 об/мин; рн 5,6. Максимальная активность инвертазы в момент выхода культуры в стэционарну|о фазу роста (37 ч) составляет 9,2 Еlмл; удельная активность

9,8 Е/мг белка, Пример 4. Способ осуществляют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют Saccharomycess

carlsbergensls 48-16 ССУ, которые выращивают в 100-литровом ферментере с 70 л среды, содержащей. г/л: пептон 20. сахароза (техн.) 20, В качестве инокулята используют

2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментэции: 8085 насыщения 02; 780 об/мин; рН 5,7.

Максимальная активность инвертаэы в момент выхода в стационарную фазу роста (42 ч) составляет 16,8 Е/мл; удельная активность 18,2 Е/мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход фермента в среду, сократить продолжительность процесса культивирования с 72 до 40 ч, т.е. в 1,8 раза.

Препарат инвертазы, полученный предлагаемым способом (удельная активность

13,2 Е/мг белка). содержит значи ельне меньше посторонних белков и примесей других веществ в отличие от препаратов, получаемых выделением ннвертаэы непос5 редственно из клеток после их разрушения

{2,05 Е/мг белка), что дает основание упростить процесс очистки фермента.

Так как в предлагаемом способе используют хлебопекарные дрожжи, а инвертаэа

10 накапливается в среде и для ее выделения не требуется разрушать биомассу, то возникают предпосылки для рассмотрения вопроса об использовании биомассы. остающейся после отделения жидкой фазы, 15 содержащей внеклеточные ферменты, для пищевых целей или для выделения ценных внутриклеточных компонентов, (56) Патент США

20 N 3887434, кл. С 12 D 13/10, 1975.

TsIomenko A,В., Lupashin V.V., КШаеч

i.S. Export of enzymes in culture medIum by

)east of Saccharomyces genus. In.:

International sympozlum of extracellular

25 enzymes of mlcroorganlsms. Bechlne castle.

Czech, Abstracts, 1986. р,41-42.

1471559 - И Ф - -yam еиглямй pw,;

А-А . М л бкоте Ьт етимой ипЬряаюм, 8 гонпроЛНюН Варином», - ав идегт Жевжмюгю шЮе жзм

Ю миеен Фариас, - Мамию Риимцирама

Составитель И,Привалова

Техред M.Mîðiåíòàë Корректор А, Мотыль

Редактор Л.Волкова

Заказ 3335

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101