Способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы

 

Союз Советскик .

Социалистические

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ()721451 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 27. 12.77 (21) 2560842/23-04 (51)M. Кд.

С 07 5 7/02//

A 61 К 37/48 с присоединением заявки М

Гееударстамя1ы!1 кемитет

СССР

N делам наебретения к еткрмтвй (23) Приоритет

Опубликовано 15.03.80. Бюллетень Ж 10

Дата опубликования описания 17.03.80 (53) УДК577.15..07 (088.8) Л. С. Лосякова, Л. И. Голгер, Э. П. Москвичева, Э. М. Трефилов, А. А. Каменский, M. С. Гульман, Б. Н. Федорен и И. В. Писаревская ф

Э (Всесоюзный научно-исследовательский биотехни герцки!! институт: „ -": (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПСЛУЧЕНИЯ ОЧИШЕННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ ГЛ ?ОКОАМИЛАЗ? !

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к ферментной области микробиологической промышленности — к способу получения очищенных ферметных препаратов глюкоамилазы (КФ 3.2.1. 1)- и может быть использовано для производства очищенных препа— ратов глюкоамилазы с целью применения их в крахмало-паточной, спиртовой, хлебопекарной промышленности.

Известны способы получения очищен10 ных ферментных препаратов из ферментсодержащих растворов, например из фильтрата культуральной жидкости, предусматривающие предварительное концентрироваf5 ние растворов, например, вакуум-выпариванием и выделение ферментов в виде осадка органическими растворителями, таннином или сульфатом аммония с последующим высушиванием осадков лиофи20 лизацией или распылением El) и (21.

Препараты ферментов, полученные эти— ми способами, имеют невысокую степень очистки, а в процессе вакуум-упаривания культуральной жидкости, например в

10 раз, наблюдаются значительные потери ферментативной активности. Сокращению потерь способствует добавление в ферметные растворы перед упариванием или сушкой стабилизирующих веществ, специфичных для каждого вида фермента, Для повышения выхода ферментов и улучшения степени очистки концентрирование ферментных растворов осуществляют методом ультрафильтрации через специальные мембраны с размером пор, не превышающйм величины молекулы данного фермента. При этом в ряде случаев процессы ультрафильтрации ферментных растворов и осаждения проводят в определенных зонах рН, устанавливаемых для каждого ферментного раствора 14) (6J

Наиболее близким к изобретению является способ получения очищенных ферментных препаратов, в том числе глюкоамилазы P3J в которсм прет смотрено концентрирование ферментного раство3 7214 ра ультрафильтраци и без корректировки рН и без стерильной фильтрации с последующей сушкой ферментов на распылительной сушилке со стабилизаторами в виде крахмала, продуктов его гидроли5 за, желатина, полигликолов и т.п. в дозировках по весу сухих вецеств в раство, ре и досущивание в псевдокипяшем слое.

Недостатками известного способа являются низкий выход и низкое качество продукта.

Глюкоамилазу получают известным способом с большими потерями, и препарат может быть загрязнен спорами.

Применяемые в известном способе стабилизаторы недостаточно эффективны, так KQK снижают выход глюкоамилазы и стабильность препарата при хранении.

Кроме того, дозировка стабилизаторов ферментативной активности по содержанию 0 сухих веществ в растворе не является достаточно надежным способом для сохранения максимальной активности ферментов.

Белью изобретния является устране- ние недостатков известного способа, а именно повышение выхода продукта и получение ферментных препаратов высокого качества с заданной степенью очист$0 ки.

Согласно изобретению предлагается способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы с высоким выходом и качеством целевого продукта посредством стерильной фильтрации ферментного раствора последующей ультрафильтрацией при значениях рН 4,0-4,2 и 5,0-6,5 соответственно. В процессе последующей сушки в качестве стабилизатора ферментативной активности прн- 40 меняют смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении 5.1 в количестве 15-45 мг на 1000 единиц активности фермента глюкоамилазы.

С целью увеличения выхода продукта, 4S интенсификации процесса и повышения качества ферметного препарата по предлагаемому способу предлагается перед ультрафильтрацией проводить осветление и стерильную фильтрацию ферментных растворов через мембраны, задерживаюшие бактериальные клетки, при этом перед стерильной фильтрацией для ускорения процесса, повышения выхода продукта и уменьшения потерь рН культуральной жидкости необходимо устанавливать в пределах 4,0-4,2, а перед ультрафильтряцией скорректировать рН llo

5,0-6,5. В качестве стабилизаторов глю51 4 коамилазы в процессе сушки необходимо использовать углекислый магний и бензойную кислоту в соотношении 5: 1. Дозировку стабилизаторов необходимо осуществлять не по отношению к объему ферментного раствора или весу сухих веществ, содержащихся в растворе (как это принято обычно), а по отношению к единицам активности глюкоамилазы, содержащейся в ультраконцентрате.

lt р и м е р 1. Культуральную жидкость после выращивания плесневого гриба AS/. И1ЯЩ Т-ЗЗ, освобожденную от мицелия на фильтр-прессе ФПАКМ, имеющую концентрацию сухих веществ

7%, глюкоамилазную активность 42ед/мл и значение рН 3,0, концентрируют методом ультрафильтрации, а змем ультраконцентрат высушивают на распылитель— ной сушилке при температуре сушильного агента 115 С на входе и 68 С о на выходе. Кратность концентрирования десятикратная, скорость ультрафильтрации 5 л/м ч., глюкоамплазная активность

2. ультраконцентрата 4 12 ед/мл.

Полученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную активность

3560 ед/г и обсемененность 2,6 10

Общие потери ферментативной .активности саста вляют 23,4%.

Пример 2. Ферментный препарат глюкоамилазы получают, как в примере

1, но с целью получения препарата, очищенного от посторонней микрофлоры для удовлетворения требованиям пищевой промышленности, вводят стадию стерильной фильтрации перед ультрафильтрацией культуральной жидкости. Стерильную фильтрацию проводят при исходном значении рН 3,0. Скооость стерильной фильтрации 40 л/м .ч. В очищенном от микроорганизмов фильтрате культуральной жидкости повышают рН до 5,0, а затем проводят ультрафильтрацпю. Ско2 рость ультрафильтрации 10 л/м ч. Кратность концентрирования десятикратная.

Глюкоамилазная активность ультраконцентрата 408 ед/мл. Потери ферментативной активности при стерильной фильтрации и ультрафильтрации 3%. В ультраконцентрат перед сушкой распылением добавляют стабилизирующую смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении 5:1 из расчета 15 мг на 1000 единиц активности глюкоамипазы. Температура сушильного агента

115 С на входе и 65 С на выходе.

72145 1

5

11олученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную «ктивлость

3985 ед/г и обсемененность — следы.

Общие потери ферментативной активности

12,7%.

Пример 3. Ферментный препарат получают, как в примере 2, но рН в культуральной жидкости перед стерильной фильтрацией повышают до 4,0. Скорость стерильной фильтрации 60 л/м ч. B 10 фильтрате культуральной жидкости после стерильной фильтрации повышают рН до

6, 5, а затем проводят ультрафильтрацию. Скорость ультрафильтрации 10л/м ч.

При кратности концентрирования в 10 раз 15 активность глюкоамилазы в ультраконцентрате составляет 408 ед/мл. Потери глюкоамилазной активности при стерильной фильтрации, ультрафильтрапии составляют 3%. Перед сушкой распылением в ультраконцентрат добавляют для стабилизации активности глюкоамилазы смесь углекислого магния и бен— зойной кислоты в соотношении .5:1 из расчета 45 мг на 1000 единиц актив- 25 ности. Режим сушки, как в примере 1.

Полученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную активность

400 ед/г и обсемененность — следы.

Общей потери ферментативной активно- 30 сти 12,4%.

Пример 4. Ферментный препарат глюкоамилазы получают, как в примере

3. В фильтрате культуральной жидкости перед стирильной фильтрацией доводят, 35 рН до 4,2, а перед ультрафильтрациейдо 5,5. Параметры процессов стерильной фильтрации и ультрафильтрации те же, что в примере 3. В ультраконцентрат перед сушкой распылением добавляют

40 стабилизатор-смесь углекислого магния и бензойной кислоты при соотношении 5: 1 в количестве.30;,мг на 100 единиц активности глюкоамилазы. Режим сушки как в примере 1.

Полученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную активность

400 ед/г и обсемененность — слепы.

Общие потери ферментативной ак гивности 12,4%.

Формула изобретения

Способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы путем ультрафпльтрации ферментного раствора, добавления в концентрированный фбрментный раствор стабилизаторов ферментативной активности и последующей его сушки, о т л и ч а ю шИ и с я тем, что, с целью повышения выхода и качества целевого продукта, ферментный раствор предварительно подвергают стерильной фильтрации, а затем ультрафильтрации при значениях рН 4,0-4,2 и 5,0-6,5 соответственно, а в качестве стабилизаторов ферментативной активности применяют смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении

5:1 в количестве 15-45 мг на 1000 единиц активности фермента глюкоамилазы.

Источники информации, T винятые BG внимание при экспертизе

1.,вторское свидетел=ство СССР

% 340690, кл. С 07 Я. 7/02, 1971.

2. Авторское свидетел ство СССР

М 495347, кл. С 07 5 7/02, 1975.

3. Патент Франции М. 210669, кл. С 07 $ 7/02, опублик. 1972 (прототип).

4. Лвторское свидетельство СССР

%343991, кл. С 07 ф 7/02, 1971.

5. Авторское свидетельство СССР

Хо 535345, кл. С 07Ц. 7/02, 1975.

6. Лвторское свидетельство СССР

Я 480721, кл. С 07 Q 7/02, 1974.

Составитель Г. Коннова

Редактор E. Хорона Техред С, Мигай Корректор Г. Решетняк

Заказ 77/21 Тираж 495 Подписное

ЦН11ИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал 11ПП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4