Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста

 

Изобретение относится к области генной инженерии и касается способа получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, получена путем выделения мРНК из гипофизарных желез быков с последующим получением кДНК и клонированием полученной кДНК в PBR 322. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

„,SU „„1471

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК цр 4 С 12 М 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ВСЕСОЮЗНАЯ

И1Й1иЗ TE),pl{gg{,Qg

Б {БЛ{ {ОТЕйА

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3345603/28-13 (22) 23. 10. 81 (46) 07.04.89. Бюл. Р 13 (71) Дзе Радкентс Оф Дзе 10ниверсити оф Колифорния (US) (72) Уолтер Л. Миллер (115), Джозеф

А. Мартиал (BE) и Джон Д. Бакстер (us) (53) 375.224. 2; 577. 2(048)(088.8), (56) Мероу Дж. Уоэит Дж., Эфетратиадис

А. Исследование фибриона шелка,- В кн.: Рекомбинантные молекулы, значе-, ние для науки и практики. Перевод с. .англ. — М,:I Наука, 19?7, Р.,?, с. 476484.

Изобретение относится к генной инженерии и касается способа получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста.

Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, получена путем выделения мРНК .из гипофизарньнс желез быков с последующим получением кДНК и клонированием полученной кДНК в pBR 3212.

Пример. 1. Гипофизарии коров извлекают вскоре после умерцвления коров и сразу же заморажнвают в

:жидком азоте. Рибонуклеиновую кислоту (PHK) приготавливают путем гомогенизирования гипофизариев в растворе тиоцианата гуанидина. Затеи PHK экстрагируют -фенолом и осаждают в этаноле. Полиаденилнров анную РИК очи, щают, используя метод адсорбционной (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЙАЗЖДНОЙ ДНК, . КОДИРУИЩЕЙ

БЬЙИЙ ГОРМОН РОСТА, (57) Изобретение относится к области генной инженерии и касается способа получения рекомбинантной плазмидной

ДНК, кодирующей бычий гормон роста.

Рекомбинантная плаэмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, получена путем выделения мРНК из гипофизарных желез бы1сов с последуюцим получением кДНК.и клонированием полученной кДНК в pBR 322. 1 э.п. ф-ювс, 1 табл.

2 хроматографии с применением олигоdT-целлюлоз ы.

Полиаденилиров анную PHK транслируют в свободной от клеток суспен.зии используя ретикулоциты кролика.

Предшественника гормона роста быков, синтеэированньй в этой системе, жунн9 осаждают с использованием гетеро. логической антисыворотки антиовечьего гормона роста и выделяют путем ,адсорбции к фиксированному формалиновому штамму 1 .Соиап Staphy lococcus

acreus. 35, S-белки подвергают электрофорезу на 12,5Х S0S полиакриламидных г.елях. Этот анализ показывает, что полианилированная PHK кодирующая предварительный гормон роста быков, составляет примерно 12,6Х от об.щей гипофиэарной полиаденилированной

PHK.

1471949

20

ЗО Полиаденилированную PHK траскрибируют в одноцепочечную с ДНК с использованием обратной транскриптазы.

PHK удаляют путем щелочного гидролиза. Одноцепочечную с ДНК экстрагируют фенолом, подвергают хроматографическому разделению при пропускании над G-50 Sephadex и осаждают этанолом. Одноцепочечную ДНК используют как основу для синтеза второй цепи кДНК с применением обратной транскриптазы. Одноцепочечнув "гепариновув петлю" у 3 -концевой части первой молекулярной цепи кДНК удаляют путем обработки нуклеазой Sp. Двухцепочечную с ДНК очищают экстракци- ей фенолом, подвергают хроматографическому разделению при пропускании над G50 Sephadex и осаждают в этаноле. Двухцепочечнув кДНК снабжают концевым звеном dCMP с использованием

dCTP и концевой трасферазы.

Плазмиду pBR 322 расщепляют эндонуклеазой. Pst I и снабжают концевым звеном dGMP c тем исключением, что вместо dCTP используют dGTP. 50 нг расщепленной Pst I плазмиды pBR 322 с dG-концевой частью и 20 нг двуцепочечной кДНК с 86-концевой частью отжнгают в 50 мкл реакционной смеси.

Трансформацию Е. coli Х. 1776 плаз» мидой осуществляют как описано ниже.

Штамм Е. coli Х 1776 становится проницаемым для ДНК в результате выдержки в термостате в 75 мкИ СаС1, 5 мкИИ@С1, 10 мкИ Трис, рН = 7,5 в течение 20 мин. при 4 С. Плазмиду и бактерии выдерживают в течение 60 мин при 4 С и затем в течение 2 мин при

41 С. Преобразованные колонии отбирают ио стойкости к тетрациклину.

Присутствие размноженной ДНК определяют путем гибридизации колоний кДНК зондом, меченным 32Р и кодирующим гормон роста быков. Плазмнду ДНК выделяют из отобранных колоний, расщепляют Pst I, подвергают электрофорезу на 17.-ной агарозе, обрабатывают этидийбромидом, фотографируют и, на- . конец, переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Наличие последовательностей гормона роста определяют путем гибридизации с полной цепью кДНК гормона крысы, меченной nick-. трансляцией.

Получакт один клон, который гибридизировался с nick-транслированной DNA и обозначенной как рВР 348. Введенная йоследовательность включала 8831 пар оснований.

Пример 2. Плазмиду рВР 348

I расщепляют Pst I, фосфат у 5 -концевых звеньев фрагментов ДНК удаляют путем обработки щелочной фосфатазой и и заменяют меченным (Р1 фосфатом с использованием полинуклеотидной киназы. Затем плазмиду рВР 348 расщепляют Pst I, Pvu II или Sau ЗА, меченными t ) j ATP, и полинуклеотидной киназой, а после этого расщепляют другими ферментами с образованием фрагментов ДНК, меченых в одиночной концевой части. Эти фрагменты получают путем элюирования из полиакриламидного геля и устанавливают последовательность.

Аминокислотные положения нумеруют, начиная с аминокислоты с аминовым концом гормона роста быков в направлении к карбоксильному концу и в направлении к первому AUG кодону, который, как предполагается, является точкой начала трансляции. Данная nol следовательность кодирует синтез гормона роста, включающий послетрансляционнув обработку. Трансляция гормона роста MRNA приводит к предшественнику гормона роста, включающему сигнальный пептид.

Пример,3. (А) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере I используя плазмиду

pBR 315 вместо, плазмиды pBR 322 ° Все условия, включая отбор рекомбинантных клонов, описаны ранее.

Введенную последовательность удаляют и анализируют аналогично примеру 2, в результате чего получают ДНК, содержащую примерно 831.п.о. (В) Осуществляют процедуру таким же образом,: как описано в примере I с использованием плазмиды pBR 316. вместо плазмиды pBR 322; Все условия идентичны описанным в примере 1.

Пример 4. В данном примере сДНА, кодирующув предшественник гормона роста быков, получают по примеру 1 (А) Линкеры Hind III,,имеющие nof Ф следовательно сть 5 -ССААССТТСС-3 соединяют с кДНК, полученной по примеру 1, за счет связывания обрезанных концов с использованием .Т DNA лигазы. После связывания продукт обрабатывают посредством Hind III или

Hsu I Плазмиду pBR 322 расщепляют

5 147

Hind III или Hsu I и подвергают обработке щелочной фосфатазой. После осаждения из этанола обработанную фосфатазой расщепленную pBR 322 соединяют с кДНК, содержащей линкер

Hind III. E. coli X 1776 трансформируют рекомбинантной плазмидой и отбирают по чувствительности к тетрациклину. Получают колонию, включающую введенную последовательность, которая гибридизируется с nick-транслированной ДНК. Введенную последовательность удаляют путем расщепления с Hind III или Hsu I и анализируют, как описано в примере 2. Введенная молекула содержала примерно 830 пар оснований. (В) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4, в котором использовалось несколько векторов вместо pBR

322, однако вместо плазмиды рВК 322 используют плазмиды рЯС 101, рМВ9, pBR 315 и pBR 316. Все условия, включая отбор рекомбинантных клонов, аналогичны описанным. Для всех плазмид получаюа идентичные результаты, т.е. в каждом случае получают рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, кодирующую гормон роста быка. (С) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 4 (А), но используют несколько других сайтов рестрикции и эндонуклеаз рест. рикции. В данном примере используют линкеры Sal I u Bam Н I вместо линкеров Hind III. Последовательности лиикеров представляют собой

5 -ССТССАСС-3 и 5 -CCGGATCCGG-3

При использовании линкеров Sal I кДНК и pBR 322 расщепляют эндонуклеазой Sal I а при использовании линкеров Ваш Н ? эндонуклеаза ограничения представляет собой Bam Н I. Bce условия, включая отбор рекомбинантных клонов, описаны в примере 4 (А) . (D) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (С), в котором вместо плаэмиды pBR 322 используют плазмиды pSC 101, pMB9, pBR 313, pBR 315 и pBR 316. Все условия такие же, как в примере 4 (С) и получают идентичные результаты. (Е) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4.(А) с использованием линкера Eco RI, имеющего последовательность 5 -CCGAATTGG-3, вместо линкера Н!.пй III и с использованием эндонуклеаэы Eco RI вместо Hind III

1949

6 (Hsu I} . Транформиров ание колонии не отбирают по чувствительности к тетрациклину.

5 (F) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (Е), но с использованием плазмид pSC 101, -рМВ 9, рВР

313 и pBR 315 вместо pBR 322. Используют те же условия, что описаны в

)p примере 4 (Е), и для каждой плазмиды получают идентичные результаты. (G) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованием линкера Pst I, имеющего последоваt 1 тельность 5 -GCTGCAGC-3, и с использованием Рз Е эндонуклеазы вместо сайта Hinl III и вместо Hind III (Hsu I) соответственно. Используют идентичные условия с той разницей, что отбор рекомбинантных клонов осуществляют, как описано в примере li

Получают рекомбинантный клон. (Н) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (G), но используют

25 плазмиды pBR 315 и pBR 316 вместо плазмиды pBR 322. Используют те же условия, что описаны в примере 4 (С), и получают идентичные результаты. (g) Осуществляют процедуры таким

30 же образом, как описано в примерах 1

3 (А), 3 (В) и 4 (А) — (Н), с использованием Е. coli RRJ или Е. coli НВ

101 вместо Е. cali Х 1776. Все условия и результаты идентичны описанным.

Пример 5. В данном примере получают cDNA, кодирующую предшественник гормона роста быков, как описано в прикере l. Линкеры Есо RI соединяют с кДНК и рас4 щепляют посредством Есо RJ. (А) В качестве вектора используют

Charon 16А. Когезионно связанные концевые части обрабатывают путем вьцер— жки в течение 60 мин при 42 С в 0,1 М

Трис-НС1, рН = 8,0 и 10 мМ HgCl .

Данный вектор расщепляют в сайте

:Есо RI эндонуклеазой Есо RJ и затем подвергают обработке щелочной фосфатазой. После осаждения из этанола в обработанный фосфатазой вектор ЬЕсо

RI сайт вводят кДНК при молярном соотношении 2 моль вектора на. 1 моль.

Эту смесь сшивают лигазой фага Т .

Полученной смесью трансформируют,суспензию клеток E. coli Х 1776, приготовленную для преобразования, как описано в примере 1. Рекомбинантные фаги извлекают и наносят на .Ьас бактерии в чашках, содержащих 5-хлор-41471949

-бром-3-индолил-P-D-глактозид (Х6), для продуцирования,бесцветных негативных колоний отбирают рекомбинантные фаги (80 мкг/мл), содержащие сДНК в Е. coRJ сайте вектора Charon

16А. Отобранный рекомбинант изолируют и обрабатывают избытком эндонуклеазы Есо RJ и продукт обработки анализируют, как описано в примере 2. Извлекают ДНК с длинной цепью, включающей примерно 830 пар оснований. Полученные фаги упаковывают in vitro. (В) ДНК фагов Charon ЗА или 4А используют в качестве вектора вместо

ДНК Charon 16А. Все условия были идентичны тем, что описаны для ДНК

Charon 16А. Выбор рекомбинантных фагов осуществляют путем нанесения фагов на Lac бактерии в чашках, содержащих Х6, и изолирования бесцвет-. ных негативных колоний с последующими либо гибридизацией с соответствующей пробой, или обработкой эндонуклеазой. Эту введенную последовательность удаляют, как описано ранее, в результате чего получают ДНК с длинной цепью примерно 830 пар осно» ваний. (С) ДНК фага g gt МЕЯЪВ используют в качестве вектора вместо Charon 16А.

Все условия идентичны описанным для

Charon 16А. Отбор рекомбинантных фагов осуществляют по способу гибрициз ации.

Введенный фрагмент удаляют, как описано ранее, в результате чего получалась ДНК, включающая примерно

830 пар оснований (длина цепи). (D) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примерах

5(A) — (С), в которых использовались

Е. coli RPJ Е. coli НВ 101, Е. coli

DP 50 или Е. coli DPS иф Р, вместо

Е. coli X 1776. Все условия идентичны и получают идентичные результаты.

Пример 6. Для осуществления данного примера получают сДНК, кодирующую предшественник.гармона роста, как описано в примере 1. Вводят линкеры Hind III и кДНК обрабатывают посредством kIind III или

Hsu I, как описано в примере 4(А).

Плазмиду рС 194, изолированную из S. aureus используют в качестве вектора. рС 194 расщепляют в зоне

Hind I l посредством Hind III или

Hsu Т и затем подвергают обработке щелочной фосфатазой, Полученную кДНК соединяют с расщепленной рС 194. Осуществляют трансформацив В. subtilis Ru8. Клеточную суспензию наносят непосредственно на L чашки, содержащие 3 мкг хлорамфеникола. Отобранный рекомбинант изолируют и обрабатывают посредством Hind III и продукт расщепления анализирувт, как описано в примере 2.

Извлекают ДНК длиной цепи примерно

830 пар оснований.

Пример 7. (А) Плазмиду

pBR 348 обрабатывают эндонуклеазой

15 Нае II с образованием фрагмента, включающего 1600 п.о. Однако эона

Нае II находится в пределах введенной кДНК, кодирующей предшественник гормона роста, а вторая зона — в

2р пределах фрагмента плазмиды pBR 322. . В результате расщепления получают

f {

5 -С ТТС ...,3

3 -GCGGAA ...,5

Бычий GH (гормон роста) начинается либо с +1 аlа, либо с +2 phe остататочного звена в концевом по-. ° ложении NH . Удаление кодона аlа

Зр осуществляют путем выдержки в термостате ДНК вместе с dATP и фрагментом

Кленова DNA полимеразы I. В результате этой реакции получают.

5 — С ТТС ....3

35 3 — ААС ...,5

ДНК экстрагируют фенолом и осаждают. Избыток dATP и,дигерированные основания удаляют путем хроматографии на G50 Sephadex. Оставшееся 5 звено

40 удаляют нуклеазой S,. В результате такого расщепления получают

5 — ТТС ...,3

f I

3 — AAG- ° ...5

45 (В) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере

7(А), в котором деэоксинуклеотидную последовательность, кодирующую пред/ шественника гормона роста быка, уда5р ляют путем обработки рекомбинантных

ДНК, полученных в примерах 3, 4, 5 и 6 эндонуклеазой Нае II.

Используемые векторы и эндонуклеазы показаны в таблице.

После обработки ферментом рестрикции изолируют последовательность предшественника гормона роста быка посредством гельэлектрофореза и эа9 147 тем ее подвергают обработке, как описано в примере 7(А), при этом получают идентичные результаты. (С) Осуществляют процедуры таким же образом как описано в примерах

7 (А) и 7 (В), с использ ованием Т ДНК

) gl полимеразы или 3 - 5 экзонуклеазы вместо фрагмента Кленова ДНК полимеразы I.

Все другие условия идентичны и в каждом случае получают идентичные последовательности фрагмента гормона роста быков.

Пример 8. (А) фрагмент.гормона роста быков .

5 — С ТТС ....3

I

3 — GCCGAAG .... 5 получают путем обработки Нае II как описано в примере 7(А) или 7(В). 3атупление осуществляют следующим образом. ДНК, выдерживают в термостате с dATP, dGTP, dCTP, dTTP и фрагментом Кленова ДНК полимеразы I. В результате этой реакции получают

5. — GG СС ТТС ....,3

3 — GCGGAAG ..., 5

ДНК экстрагируют фенолом и осаждают °

Данную последовательность затем выдержйвают в термостате с фрагментом

Кленова ДНК полимеразы Е в присутствии dCTP. Эту последовательность за тем обрабатывают Я, нуклеазой, в результате чего получают последовательность

5 — GCC ТТС ....3

3 — CGG AAG ..., 5 (В) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере

8(А),. с использованием Т4 ДНК полимеразы или 3 — 5, т.е. в присутствии

dCTP.

Пример 9. Дезоксинуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста быков, вводят в векторы переноса, как описано для предшественника гормона роста быков. (А) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах

1, 3 (А), 3 (В), 4 (А) — Я), 5 (А) ,(D) и 6, а использованием ДНК, приготовленной аналогично примерам 7 (A), 7(В) или 7(С) . Все другие условия идентичны. ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами, как показано в таблице, и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае по1949

g0 Иммунный комплекс осаждают и иэмеря35

55 лучают ДНК с последовательностью, начинающуюся с Phe в положении 2. (В) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах 1, 3 (А), 3 (В), 4 (А) — (.Г), 5 (А) — (D) и 6, с использованием ДНК, приготовленной согласно примеру 8(А) или

8(В). Все другие условия идентичны.

ДНК расщепляют соответствующей эндо-. нуклеазой (как показано в таблице) и анализируют, как описано в примере

2. В каждом случае получают ДНК, имеющую последовательность, начинающуюся с Ala кодона.

Пример 10. (А) Экспрессию предшественника гормона роста быка как белка слияния демонстрируют с помощью радиоиммунного анализа и

"миниклеточного" эксперимента. В эксперименте с радиоиммунным анализом

Е. coli Х 1776, содержащие pBR 348, или Е.,coli, содержащие pBR 322, как контроль, выращивают в питательном бульоне и извлекают посредством центрифугирования. Клетки повторно суспендируют и лизируют, и в гормон роста вводят радиомеченый гормон роста овец и антитело овец (или быков). ют радиоактивность. Эксперимент показал, что белок слияния сохраняет некоторую ж муноактивность гормона роста быков. Для более подробной иллюстрации продуцирования белка слияния осуществляют "миниклеточный" эксперимент. Данный эксперимент показывает, что pBR 348 образует белок слияния, состоящий из 183 аминокислот -лактамазы, 217 аминокислот предгормона роста быка и несколько связывающих аминокислот, ко ированных обычно, нетранслированной 5 зоной. Общий молекулярный вес, составляющий примерно 45000, соответствует предсказанному молекулярному весу гибридного белка. (В) Для прямой экспрессии предшественника гормона роста быка введенную ДНК сначала отделяют от pBR 348 путем частичного расщепления эндонуклеазной Pst I и очищают посредством препаративного гель-электрофореза.

15 мкг образца очищенной введенной

ДНК затем модифицируют путем суспензирования ДНК в воде, в которую вводят раствор солей так, чтобы конечная композиция содержала: 70 лй1 Трис, рН = 8,8; 70 мМ И@СЕ, 10 мМ дитио147194

40 треитола и 13,75 молекулярных звеньев полимеразы ДНК в общем объеме 250 мкл.

Реакционную смесь выдерживают в теро мостате при 37 С в течение нескольких минут, затем вводят dATP до концентрации 50 м1 . После. дополнительной выдержки в термостате в течение 30 мин фермент инактивируют путем термообработки при 65ОС в течение 5 мин. Этот процесс повторяют еще два раза, один раз с использованием dCTP и dATP, а затем снова с использованием dTTP.

Обработанную DNA извлекают путем осаждения этанолом. Обрабатывают S нуклеаэой, Данный процесс обеспечивает получение молекулы ДНК, заканчивающейся в начальном кодоне в положении эа номером 26. Такие молекулы транслируются при вводе в вектор экспрессии, имеющий зону ввода, соответствующую примерно 3 — 11 нуклеотидам от последовательности рибосомного связы,вания.

Вектор прямой экспрессии конструируют путем модификации плазмиды ptrp

ЕЗО, путем удаления 23-29 нуклеотидов с использованием Т РНА полимера . эы и S< нуклеаэы, как описано ранее.

МодиФицированную кДНК и модифицированный вектор экспрессии снабжают линкером, имеющим последовательность

5 -ССССАТСССС-3 у одной цепи, и гомологичную ей последовательность у другой цепи посредством связывания с использованием лигазы. Эти линкеры обеспечивают наличие Bam Н+ сайтов.

Бактерии-хозяева Е. coli НВ 101., ККЭ или X 1776 трансформируют посредством рекомбинантных ДНК, несущих фраг»

9 12 те в течение 10 мин. Клетки извлекают путем центрифугирования, промывают и снова суспендируют в 250 мкл буферного раствора, содержащего 10% гликоля, 5% Р-меркаптоэтанола и 2,3% SDS в

0,0525 М Трис, рН = 6,8. Суспензию кипятят в течение 5 мин, затем вводят в 10%-ный гель SDS полиакриламида и фракционируют посредством электр рофореза. Полосы, соответствующие белковым зонам, визуально наблвдают посредством ауторадиографии. Результаты показали наличие новой белковой полосы, составляющей примерно 24000 дальтон, которая отсутствует в неиндуцированных или непреобраэованных куль тур ах.

Предшественник гормона роста быков очищают обычными способами, включающими, например, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, адсорбционную хроматографию и методы, основанные на различии растворимостей. Предшественник гормона роста превращают в гормон роста. (С) Линкеры с последовательностью

5 -CCGGATCCGGATG-3 у одной цепи и гомологичной ей последовательностью у другой. цепи соединяют фрагментом

ДНК, кодирующим гормон роста, быка, полученным аналогично примерам 7(А)— (С) и 8(А) — (В). Эту модифицированную DNA затем вводят в вектор ptr. рЕ 30,. как описано в примере 10(B).

Бактерию-хозяина трансформируют и культивируют, и получаемый в результате гормон роста быков очищают, как описано в примере 10(В).

Формула изобретения мент, кодирующий предшественник гормона роста, и трансформаты отбирают по стойкости к ампициллину. Единственный трансформант, обозначенный как рйr pE30/bGH отбирают для дополнительного анализа.

Бактериальные клетки, трансформированные плазмидой ptr РЕЗО/bGH, вы/ ращивают в стандартной, минимальной среде (М9), содержащей LeU PrÎ, ви- 50 тамии В1 и ампициллин, при 37 С. На ранней логарифмической фазе trp оneрон индуцируют путем ввода Р.-индолилакриловой кислоты (30 мкг/мл среды).

KoHTpoльные культуры Оставались не индуцированными. По прошествии 3 ч роста 1„5 мл клеток, подвергают радиоактивному мечению путем ввода 20,мк

Ci S-L-Met и выдерживают в термоста° $+

1. Способ конструирования реком— бинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийся в том, что выделяют полиаденилированную мРНК из гипофиза быка, очищают поли А мРНК адсорбционной хроматографией с применением олиго-d-целлюлозы, обрабатывают обратной транскриптазой и получают однкДНК, удваивают полученную однкДНК .с помощьв обратной транскриптазы, полученную двунитевую кДНК последовательно обрабатывают эндонуклазой Нае II, фрагментом Кленова, ДНК полимеразой, а затем нуклеазой Q и получают кДНК, кодирующую бычий гормон роста с 26 по 191 аминокислоту со следующей нуклеотидной последовательностью;

49

15 и клонируют ее в Pst I или EcoRI сайт вектора pBR 322. 25

Ь

Фермент Вектор переноса (Пример} ограничения

3А, ЗВ, 4С, 4Н

4А, 4В, 6

4С, 4D

4С, 4D

4Е, 4F 5А, 5В, 5С

Pst

Hind I II

Sal

Bam HI

Есо RI

Составитель Н. Кузенкова

Редактор Н. Лазоренко Техред Л. Сердюкова Корректор С .lilex aP

Заказ 1 622/58 Тираж 501 Подпис но е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

13 1471 9

5-ATGATGCCTGCAGGCCCCCGGACCTCCCTGCTCCTG

GCTTTCGCCCTGCTCTGCCTGCCCTGGACTCAGGTG

GTGGGCGCCTTCCC AGCCATGTCCTTGTCCGGCCTG

TTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCAC

CAGCTGGCTGCTGACACCTTCAAAGAGTTTGAG

CGTACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCC

ATCCAGAACACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCC

GAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAG

GCCCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGC ATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCTTGGG

CCGCTGCAGTTTCTCAGCAGAGTCTTCACC

AACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGACCGТ

GTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAA

GGCATCTTGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAA

GATGGСАССCCCCGGGCTGGGСАСАТССТС

ААССАСАССТАТСАСАААТТ?САСАСАААС

ATGCGCAGTGACGACGCGСТССTCAAG

AACTACGGTQTGCTCTCCTGCTTCCGG

AAGGACCTGCATAAGACGGAGACGTAC

CTGAGGGTCATGAAGТССCGCCGCTTC GGGGAGGCCAGCTGTGCCTTCTAG-3

2. Способ по и. 1, о тл ич а-. ю шийся тем, что двунитевую кДНК расщепляют Нае II эндонуклеазой полученные фрагменты инкубируют в 30 присутствии МАТФ, ЙГТФ, ЙЦТФ и ЙТТФ последовательно обрабатывают фрагментом Кленова, ДНК-полимеразой фага Т !, или 3 -5 в присутствии йТТФ с последующей обработкой эндонуклеазой

S< и получением кДНК, кодирующей гормон роста быка со следующей нуклеотицной последовательностью

5 -GCCTTCCCAGCCATGTCCTTGTCCGGCCTGTTT

GCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCAC

CAGCTGGCTGCTGACACCTTCAAAGAGTTlGAG

CGTACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCC

АТССАСААСАСССАССТТСССТТСТССТТСТСС

GAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAG

GCCCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGC

ATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCTTGGGCCCCTG

CAGTTTCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTG

GTGTTQGCACCTCGGACCGTGTCTATGAGAAG ,CTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCTTGGCCCTG

ATGCGGGAGCTGGAAGATGGCACCCCCCGCGTC

ССССАСАТССТСААССАСАССТАТСАСАААТТТ

GACACAAACATGCGCAGTGACGACGCCCTG

СTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGGTTCCGGAAG

GACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATG

AAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGCCAGCTGTGCCTTCTAG