Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита а

 

СО!ОЗ СОВЕТСНИХ

СО).)ИАЛИСТИЧЕСНИК

РЕСПУБЛИК (%I)9 С 12 И 15/00, А 6! К 39/29

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗ)!ИДНОЙ ДНК, КОДЙРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДНЫХ СУБСТАНЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А, включающий встраивание фрагмента генома вируса

:гепатита А в экспрессирующий вектор, отличающийся тем, что, с целью получения полипептидных субстанций, способных вызывать образование антител при введении их в организм животных, в качестве фрагмента генома вируса гепатита А используют фрагмен ". длиной 389 п.о., кодирующий фрагмент белка UPI с 4 по 129 а.к., или фрагмент длиной

3372 и ° о., кодирующий все стр .-ктурные белки, начиная с 38 а.к. белка

11Р4, и неструктурные белки ВГА, или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий полипептидную цепь, содержащую фрагменты белков UP3 со !10 по

233 а.к. и UPI с 1 по 271 а.к., или фрагмент длиной 144 п,о., кодирующий фрагмент белка UPI с 4 по 57 а.к., или синтетический фрагмент ДНК, кодируюший фрагмент белка UPl c ll по 25 а.к., имеющий следующую структуру:

ACCAGATCCACAGGTAGGTAITGCG (2)) 4102079/28-)3 (22) 31.07.86 (46) 30.09,90. Бюл. )) - 36 (.71) Институт биоорганической химии им. )I.М, Шемякина, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов.

AMH СССР, Всесоюзный науч o-исследовательский институт молекулярной биологии и Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов (72) Ю.А. Овчинников, Е.Д. Свердлов, С.А. Царев, Е.И. Фролова, Т.О. Рохлина, В.М. Гостапшов, Т.Л. Ажикина, С.Г. Арсенян, Е.В, Снежков, С,В. Маркова, И.Е. Коврига, Ю.Ю. Кусов, Т.А. Насташенко, Н,)). Вальяно, М.С. Балаян, С,Г, Дроздов, В.Е. Чижиков, H.À.,Ïåòðoâ, С.).. Василенко, Г.Г ° Приходько,. В.H. Блинов, О.И. Серпинский, И.Х. Урманов, В.В. Кравченко, О.Г. Анджапаридзе, В.И, Чернос и Т.П, Антонова (53) 575.224.2; 577.2 (048)(088.8) (56) EP 0 )54 587 А2, кл, С 12 N 15/00, опублик. 1985. (54)(57) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ

AATTCACAGTTAGTACTGAACAAAATGT

GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCСАТАА

CGCCTAG, или фрагмент длиной 4296 п.о., содер- 29), обеспечивающую синтез полипепжащий фрагмент длиной 3372 п.о., тидов, содержащих полную р -галактокодирующий все структурные и некото- зидазу, слитую с белками ВГА, в бакрые. неструктурные белки ВГА, и фраг- териальных клетках, или плазмиду мент длиной 924 п.о., кодирующий pUR292, обеспечивающую синтез поливирусную апротеазу, способную расщеп- пептидов, содержащих полную p-га.лять синтезируемый вирусным геномом лактозидазу, слитую с белками ВГА, непрерывный полипептид на отдельные в дактериальных клетках, или плазмибелки, а в качестве экспрессирующе- ду pIFN-ful, обеспечивающую синтез го вектора используют плазмиду рбмк полипептидов, содержащих полньп т-ин1469856 терферон человека, слитый с белками

ВГА, s бактериальцых клетках, или плавкиду pSPUU, встраиваемую в вектор оеповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов s животных клетках, нли плазмиду pSPUU, встраиваемую и вирус осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в ораганизмах животных.

Целью изобретения является получение полипептидных субстанций, способнык вызывать образование антител при введении.их в организм животных.

GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCCATAACGÑÑÒÀG, В а в качестве экспрессирующих векто- слитые с р-галактоэидазой фрагменров используют любой экспрессирую35 ты белков ВГА или плазмиды pIFN-ful щий вектор, обеспечивающий синтез и pIFN-fu2, состоящие из большего требуемых вирусных белков в E. coRI-Pstl фрагмента плазмиды РВЕ бактериальных или животных клет- 322, гена зрелого -интерферона ках в частности плазмиды pUR человека, находящегося под контролем

У

291 и pUR 292, которые обеспечива- trp npoMQTopa E. cali, в котором тер-. ют синтез полипептидных субстанций минирующий кодон убран с помощью в бактерияльных клетках, например, зндонуклеазы рестрикации Hinfl и зав штаммах !".. coli K12. Полипептид- менен синтетическими фрагментами ДНК, ные субстанции представляют собой ь имеющими следующую стРУктУРУ:

AGT CAG ATG CTG ТТТ САА GGT CGA AGA GCA TCC CAG АСТ GCA

GTC ТАС GAC ААА СТТ ССА GCT ТСТ CGT AGG GTC TG

AGT CAG ATG CTG ТТТ САА GGT CGA AGA GCA ТСС САА GAT CTG СА

СТС TAC САС ААА GTT ССА GCT ТСТ CGT AGG GTT СТА G

II p m м e p ) . .5 мкг плазмиды Требуемый фрагмент элюируют феноль- .

pUR 291 расщепляют в стандартных ус- " ной экстракцией после электрофореловиях эндонуклеазой рестрикции за в низкоплавкой агарозе. ПолученPstl. Реакционная смесь содержит ный фрагмент лигируют с Pstl фраг"

10 мМ трис-НС1, 10 мМ,М8С1, 10 МИ ментом длиной 389 п.о., выделенным

2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмидной из плазмиды pHAU22. Лигазной смесью

ДНК и 5 е,а. фермента. Инкубацию осу- трансформируют компонентные клетки ществляют при 37 С в течение 1 ч. штамма E. coli BMH 71-18.

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и. может быть использовано для получения генно-инженерной вакцины против ге" патита А.

: В качестве генома вируса гепатита

А {ВГА ) используют фрагмент длиной

4296 п.о., содержащий

25 фрагмент длиной 3372 п.о., коди. Рующий все структурные,и некоторые неструктурные белки ВГА, и фрагмент длиной 924 п.о., кодирующий вирусную протеазу, способную расщеплять синтеэируемый вирусным

AATTCACAGTTAGTACTGAACAAAATGTACCA геномом непрерывный полипептнд на отдельные белки, или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА; или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий полипептидную цепь, содержащую фрагменты белков БРЗ со

110 по 233 а.к. и UP1 с 1 по

271 а.к., или фрагмент длиной 389 п.о., кодирующий фрагмент белка UPl с 4 по 129 а.к., или фрагмент. длиной 144 п.о., кодирующий фрагмент белка Upl с 4 по 57 а.к.; или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка БР1 с ll по 25 а.к., имеющий следующую структуру:

GATCCACAGGTAGGTATTGCG

5 146

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращива-, ют в LB-среде с ампициллином и ТРТС, синтезируемый гибридный белок, со держащий полную р-галактозидазу и фрагмент белка UP1 ВГА (с 4 по

129 а.к.), выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

В результате иммунизации у одной из трех морских свинок и у одного из трех кроликов в сыворотке были обнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА.

Пример 2. 5 мкг плазмиды

pUR 292 расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции

lPstl. Реакционная смесь содержит 10 мМ трис-НС1, 10 мМ MgC1 10 мИ

2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмидной

ДНК и 5 е.а. фермента. Инкубацию осуществляют при 37 С в течение 1 ч.

Требуемый фрагмент элюируют фенольной экстракцией после электрофореза

s низкоплавкой агарозе, Полученный фрагмент лигируит с Pstl фрагментом длиной 3372 п.о., выделенным из плазмиды pHAU23 (ДАН СССР, 1985, т, 285, 1014) в реакционной смеси, содержащей О,1 мкг векторной ДНК, 0,1 мкг

ДНК-вставки в вьш еприведенном буфере в присутствии rATP (0,1 мИ). Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. coli BMH 71-18 в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют к ориентацию последнего с помощью эндонуклеазы рестрикции BamHl, Клоны, содержащие плазмиды с нуж" ной ориентацией фрагмента, наращивают в LB-среде с ампициллином и IPTG, синтезируемый гибридный белок, содержащий полную р-галактозидазу, все структурные (начиная с 38 а.к. белка UP4) и часть неструктурных белков ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворот ку морских свинок тестируют на со9856

5 i0

45 держание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами, В результате иммунизации у одной из четырех свинок в сыворотке были обнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА.

Пример 3. 5 мкг плазмиды

pIFN-ful расщепляют в стандартных условиях эндонуклеаэной рестрикции

Pstl как описано в примере 1. Полученный фрагмент лнгируют с Pstl фрагментом длиной 389 п.о., выделен-. ным из плазмнды pHAU22. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е.. coli НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bglll и ВатпН1, Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в среде И-9 с тетрациклином и бета-индолилакриловой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный гамма-интерферон человека и фрагмент белка UP1 ВГА (с 4 по

129 а.к.), выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации— морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антитела" ми, !

".ногие из иммунизированных . морских свинок и кроликов содержали антитела, способные связываться с натив-. ным вирусом.

Пример 4. 5 мкг плазмиды

pIFN-ful pHAU22 расщепляют в стандарт" ных условиях эндонуклеазой рестрикции Bglll и затем Pstl, как описано в примере 1. Полученный больший фрагмент лигируют с Bglll — (hPuull)Pstl фрагментом длиной 1243 п.о., выделенным из плазмиды pHAU23 Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е..cali НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции FcoRI u Baml.

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают 1469856 в среде М-9 с, тетрациклином и р -индЬлилакриловой кислотой, синтезируемый гибридный белок, содержащий полный

T-интерферон человека и фрагменты белков 11РЗ (со 110 по 23.а.к.) и UPl

5 (с 1 по 271 а.к.) ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют дпя иммунизации морских свинок и кро( :ликов 10

Через несколько недель после sa вершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурент(;ной реакции с человеческими антитела(,ми °

Большинство иммунизированных морс,ких свинок и кроликов содержали анти телаа .в достаточно высоких концентра циях, способные связываться с нативным вирусом.

Пример 5. 5 мкг плазмиды

pfPN-fu2 расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазной рестрикции ( Pstl как описано в примере 1. ПолученньиФ фрагмент лигируют с Pstl фрагментов длиной 3372 п.о., выделенньщ из плазмиды pHAU23. Лигазной смесью ( трансформируют компетентные клетки штамма Е. СО1й. НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью зндонуклеаз рестрикции ВН111 H EcoRI.

Клоны, содержащие плазмиды (р1Р11fu2-pHAU23) с фрагментом в нужной ориентации, наращивают в среде М-9 с тетрациклином и р-индолилакрило"вой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный 1 -интерферон человека и все структурные (начиная с 38 а.к. ОР4) и часть неструк-: турных белков ВГА, выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через НескоЛько недель после завершения курса иммунизации сыворот ку морских свинок и кроликов тести-, руют на содержание антител, способ50 ных связываться с нативиым ВГА в КоН курентной реакции с человеческими ангителами.

БОльшннствО нммунизHpОВанных МОрc ких свинок и кроликов содержали анги«55 тела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с натив-, иым вирусом.

II p H м е р 6, 5 мкг плазмиды

plFN ful расщепляют в стандартных условиях эндонуклеаэой рестрикции

Pstl как описано в примере 1, Полученный фрагмент -лигируют с PstlBamH1 фрагментом длиной 144 п.о., кодирующим фрагмент блока UPI с 4 по 57 а.к., выделенным из плазмнды

PHAU22, и синтетическим адаптором, имеющим следующую структуру:

САТ ССА GTT ТАА CTG СА

CT CAA ATT G

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма F.. coli

НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции ЕСОЮ и Baml

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают В среде М-9 с- тетрациклином и . риндолилакриловой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный g --интерферон человека и фрагмент UP1 белка ВГА (с 4 по 57 à.к.) выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских

СВИНОК И КРОЛИКОВ.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

Большинство иммунизированных морс" ких свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с нативным вирусом.

Пример 7. 5 мкг плазмиды

plFN-ful расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции

Pstl как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с синтетическим фрагментом ДНК, кодирующим фрагмент белка UPl с 11 по 25 а.к. и адапторным фрагментом, имеющим следующую структуру:

G GGT TCC G

АС GTC ССТ AGG СТТ АА

Клоны, содержащие фрагменты в нужной ориентации, наращивают в 1469856 среде М-9 с тетрациклином и р-индолилакриловой кислотой. Синтезируемый .гибридный белок, содержащий полный Ir"-интерферон человека и фрагмент бел5 ка UP1 ВГА с 11 по 25 а.к., выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после за" вершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими ан- 15 тителами.

Некоторые из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с 20 нативным вирусом.

Пример 8, 5 мкг плазмиды

pSPUU расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции BamH1, как описано в примере 1, Полученный 25 фрагмент лигируют с Pstl фрагментом длиной 3372 п.о., выделенным из плазмиды pHAU123, с синтетическим фрагментом ДНК следующей структуры:

GATCCT ATG AGG АСТ GCA

GA ТАС ТСС ТС

Лпгазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. со11 ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего.

В ДНК плазмид, содержащих фрагмен- . ты в нужной ориентации, определяют структуру сочленения методом Макса1 ма-Гилберта.

ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содер-45 . жащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка БР4) .и некоторые не структурные белки ВГА, используют .для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии CUI зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП.

Урожай вируса после трансформации высевают на эмбриональные фибробласты крысы перевиваемой линии

RAT2 tk-фенотипа ° В присутствии бромдезоксиуридина клонируют рекомбинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последовательности ВГА (ЛИВП"pSP-UU-HAU-D), наращивают иа клетках ВАТ2 .на сре.де Dulbecco в ИЕИ с 5Х сыворотки новорожденных телят. Синтезируемый .белок ВГА в виде клеточных лизатов используют для Иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

Большинство иммунизированных морс- ких свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные <. Ьязываться с нативным вирусом.

Пример 9. 5 мкг плазмиды

pSP-UU-HAU-D, содержащей фрагмент генома ВГА длиной 3372 п.о., расщепляют частично Pstl как описано в примере 1. Полученную линейную форму плаэмиды лигируют с Pstl фрагментом

924 п..о., выделенным из плазмиды

pHAU5-prot кодирующим вирусную протеазу.

Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. cali ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bam Н/, Puull, Hind И1.

В ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определяют структуру сочленений методом Максама-Гилберта.

ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D-protea с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содержащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка БР4) и некоторые неструктурные белки ВГА, используют для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии CU1 зараженных вирусом осповакцины штамма

ЛНВП. Урожай вируса после трансформации высевают на эмбриональные фибробласты крысы перевиваемой линии

RAT2 tk-фенотипа. В присутствии бромдезоксиуридипа клонируют рекомбинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последовательности ВГА, (ЛИВП-pSP-UU-HAU-Dprotea), наращивают на клетках

RAT2 иа среде Рц1Ьессо s MEM с 5Х сыворотки новорожденных телят.. Син12

1469856

На боку кролика выбривают поверхность 5 см"и скарифицируют. На эту поверхность наносят 0,1-0,2 мл вируса. На 3-4 день возникает специфическая воспалительная реакция. К 20 дню поверхность кожи очищается. Че- рез 3-4 недели после заражения отбирают сыворотку. Ее титр против осповакцины составляет 1:640, 1;1280. теэируемый белок ВГА в виде клеточ-, -ных лиэатов используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в кон курентной реакции с человеческими 10 антителами.

Болыпинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали ан титела в достаточно высоких концент, рациях, способные связываться с натив-15 ным вирусом. (Пример 10. Все операции про,делывают, как в примере 8,, но вместо иммунизации кроликов клеточным лиэатом осуществляют их вакцинацию 20, очищенным рекомбинантным вирусом

1 осповакцины с титром 5 10 Э частиц/мл

Сыворотка также содержит антитела против ВГА.

Таким образом, изобретение позволяет получать генно-инженерные продукты, которые могут быть использованы как субстанции, потенциально . пригодные для приготовления генноинженерных вакцин, поскольку они вызывают образование у животных антител, связывающих вирус гепатита А.

Составитель Т ° Забойкина

Редактор Л. Павлова Техред M.Õoäàíè÷ " Корректор С. Шевкун

Заказ 3335 . Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, Ун. Гагарина,101