Способ определения концентраций хлорофиллов а,в,с и их феофитинов

 

Изобретение относится к физикохимическим способам анализа, применяемым в гидробиологии, гидрохимии, . контроле окружающей среды и предназначено для определения концентрации фотосинтетических пигментов, вырабатываемых фотосинтезируннцими микроорганизмами в водоемах. Целью является повышение точности и ра сширение круга анализируемых объектов. В 90%- ном водном ацетоне приготавливают экстракт пигментов, измеряют интенсивность флуоресценции в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра. Повторно измеряют интенсивность флуоресценции после подкисления соляной кислотой. Время между подкислением и измерением составляет 3 мин„ Измерение проводят трггады до подкисления-исследуемого раствора при трех различных условиях возбуждения , и регистрации и трижды после подкисления при тех же условиях возбу: ;- дения и регистрации. Первьй раз при измерении преимзтаественно пары хлорофилл а-феофетин, а длина вол ны максимума возбуждения устанавливается в диапазоне 430-440 им, а соответствующая ей длина волны максимума реги страции интенсивности флуоресценции в диапазоне 670-676 нм,рторой раз при измерении преимущественно пары хлорофил в-феофетин соответственно в диапазонах 460-465 нм и 653-659 нм, . третий раз при измерении преимущественно пары хлорофил с-фео-. фетин соответственно в диапазонах 444-448 нм и 636-640 нм. 3 табл, 2 ил. с о с .4 Од СП 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1473518 (5))5 С 01 N 2)/64

) г11@t!.)P д

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fNHT СССР

1 (46) 23.01.90. Бюл. И - 3 (21) 4175448/28-25 (22) 07.01.87 (71) Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.И.Книповича (72) Э.И.Зенкевич, А.А.Шавыкин, Т.В.Зенкевич, В,М.Рыжов и Г.И.Несветова (53) 543.426(088.8) (56) К.Е.Zoftus and I.Í.Carpenter.

А fluorometric method for determining ch1orophylls а,b,ñ. J.of Marine

Research, 197 1,.v. 29, )1.3, р.319-338.

К.G.Boto, Т.S.Bunt, Selectiv

excitafion fluorometry for the deterпиnation of chlorophylls and pheophytins. Aaalitical Chemistry, 1978, vol.50, N 3, р.392-395. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ХЛОРОФИЛЛОВ а,Ь,с И ИХ ФЕОФИТИНОВ (57) Изобретение относится к физико» химическим способам анализа, применяемым в гидробиологии, гидрохимии, . контроле окружающей среды и предназначено для определения концентрации фотосинтетических пигментов, вырабатываемых фотосинтезирукнцими микроорганизмами в водоемах. Целью является повьппение точности и расширение

Изобретение относится к физикохимическим способам анализа, применяемьи в гидробиологии, гидрохимии, контроле окружыощей среды и предназначено для определения концентрации фотосинтетических пигментов (хлоро- филлов и их феофитинов), вырабатыкруга анализируемых объектов. В 90Éном водном ацетоне приготавливают экстракт пигментов, измеряют интенсивность флуоресценции в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра. Повторно измеряют интенсивность флуоресценции после подкис:ления соляной кислотой. Время между нодкисленйем и измерением составляет 3 мин. Измерение проводят трижды до подкисления исследуемого раствора при трех различных условиях возбуждения и регистрации и трижды после под" кисления при тех же условиях возбуждения и регистрации. Первый раз при измерении преимущественно пары хлоро- Я . филл а-феофетин, а длина волны максимума возбуждения устанавливается в диапазоне 430-440 нм, а соответствующая ей длина волны максимума регистрации интенсивности флуоресценции в диапазоне 670-676 нм,второй раэ при измерении преимущественно пары хлорофил в-феофетин соответственно в диапазонах 460-465 нм н 653-659 нм, третий раз при измерении преимущественно пары хлорофил с-фео- Ю фетин соответственно в диапазонах

444-448 нм и 636-640 нм. 3 табл, 90

2 ил. ваемых фотосинтеэнрующими планктонными организмами в водоемах.

Целью изобретения является повышение точности за счет оптимизации выбора условий возбуждения и регистрации и расщ рение круга анализируемых объектов.

1473518

Способ возможно использовать не только для анализа проб морских вод вдали от берега, но и для проб вод любых естественных водоемов.

Определение концентрации хлорофилов à, b, с и их феофитинов включает приготовление экстракта пигментов в 907-ном водном ацетоне, измерение интенсивности флуоресценции экстракта в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра, повторное измерение интенсивности флуоресценции после подкисления экстракта соляной кислотой и определение кон- 15 центрации пигментов по измеренным интенсивностям флуоресценции. Интенсивность флуоресценции исследуемого раствора измеряют трижды до его подкислення при трех различных условиях 20 возбуждения и регистрации и трижды после подкисления при тех же трех различных условиях возбуждения и регистрации, причем один раз при измерении преимуцественно пары хлорофилл а (хл а) — феофитин, а (фео а) дли»а волны максимума возбуждения устанавливается в диапазоне 430-440 нм, а соответствующая ей длина волны максимума регистрации интенсивности 30 флуоресценции в диапазоне 670-676 нм

1 второй раз при измерении реимущестl венно нары хлорофилл в (хл.в) — феофитин в (фео в) соответственно в диапазонах 460-465 нм и 653-659 нм; третий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с — феофитин с соответственно в диапазонах 444-448 нм и 636-640 нм.

Указанные условия измерения выби- @) раются на основе следующих экспериментально установленных данных:

1. Длины волн максимумов поглощения в синей части спектра (S,) и 45 максимумов флуоресценции в красной части спектра (Я„) для измерения пигментов в 90Х-ном водном ацетоне различны (см.табл.1).

2. Кислотные факторы К. для хлорофиллов a,Ь,с, т.е. отношения регистрируемой интенсивности флуоресценцин раствора до его подкисления (F ) к регистрируемой интенсивности флуоресценции раствора после под, 55 кисления (Р„) при неизменных остальных условиях измерения также различны и зависят от условий измерений мзБ, рег . воъв . рог (от Л макс 1 3 маис э DA g в Ф о,з ) °

При выборе условий измерений исходили из следующих соображений.

Длины волн максимумов возбуждеВоэЬ рог ния 1 „„„, и регистрации 1 „выбираются из условия максимального различения хлорофилла от соответствующего феофитина с учетом известного кислотного фактора - с одной стороны и получения максимального сигнала от хлорофиллов.а не от их феофитинов с другой. Это означает, что нри прочих равных условиях предельно обнаруживаемые концентрации для феофитинов будут несколько выше, чем для соответствующих им хлорофиллов.

Во36

Необходимо выбирать Ь„„„, и рег такими, чтобы и флуоресценция феофитинов (феофитина в указанной паре пигментов) была бы достаточно большой. В противном случае сигнал может оказаться ниже порога обнаружения данным прибором.

Диапазоны выбора 8 „"к, и для каждой пары феофитин— хлорофилл корректируются с учетом диапазонов двух других пар пигментов.

Ширина полос возбуждения и регистрации должна быть достаточно большой, чтобы иметь хороший рабочий диапазон концентраций с одной стороны, и достаточно малой, чтобы иметь хорошую селективность по каждому пигменту с другой.

На фиг.1 — 2 представлены экспериментальные данные, снятые на спектрофлуориметре 8 Ц-4800 - спектральный ход интенсивности флуоресцейции чистых пигментов при различных условиях возбуждения.и регистрации и рассчитанные на этой основе значения кислотных факторов К, т.е. отношений о! к

Ю

На основе полученных экспериментальных данных имеем, что для хл а— фео а К ф наиболее целесообразно выбирать в диапазоне 5-15. Учитывая значения Л"„ ",„", (хл а) 432 нм, и (фео а) = 411 нм (см.табл.1), м стикс получим, что для пары хл а — фео а возв

Л м к, необходимо выбирать в диапаэо5 !473518 б не 430-440 нм; при Л воэ > 440 нм на- приблизились бы к Л в" 4 (хл а), и блюдается спад F (хл а) и мы подхо- кроме того при )5„.,>448 нм очень возрастает кислотный фактор (К станони, а при нится больше 100), что снижает точ"

Л в 430 нм К станонится меньше ввэб Ф ность определения этих пигментон.

5. В указанный диапазон попадает

Дпя полосы регистрации интенсивнос(фео в) = 436 нм и с. учетои ти флуоресценции аналогичным обрарцЯКС зом имеет диапазон 636-640 нм, при

1! 65 попадает Л „,с (фео с) l0 дре < 636 нм велик Кф, при Л,„ 640 ни

429 ни (см. табл. 1). Поэтому для близко подходим к максимумам флуоресуменьшения влияния фео в и фео с не- ценции других пигментов (хл в и рсг Фео в) . обходимо сдвинуть диапазон ЛР паПри проведении подобных флуориры хл а - фео а от Л "" Р (фео в и l5 метрических измерений важное эначе» ц асс ние имеет величина ширины полосы фео c) 659 нм; для пары хл а — фео а пропускания, которая обычно указырег принимаем диапазон > „„, равный, вается по уронню 0,5 от максимума

670-676 нм.

ho>6 p6r (т.е. AA 0 5 и дЛ 0 5 ). Значения спекt I

На основе полученных экспериментральной ширины полос возбуждения и . тальных данных имеем, что и для пары регистрации в данном случае выбираже наиболее целесообразно выбирать в ются любыми приемлемыми с точки эреприбором, но, они не должны преныЛ „ (хл в) 460 нм, и Л ","„, (фео в)= шать l2 нм по следующим причинам.

= 436 им, получим, что для пары хл в—

Расстояния по шкале длин волн воз-, буждения мвкду установленными диапафео в Лв„ „, необходимо ныбирать в зонами выбора.Л„„ для хл а - фео а и хл.

30 диапазоне 458-465.нм, при 3»<)465 нм с- фео с равно 4 нм, между диапазонами кислотный фактор К возрастает и пре- хл с — фео с н хл в - фео в - lO нм. вышает К,g !5, пРи Лвеэ5 < 458 нм Расстояние по шкале длин волн реК4 становится меньшим 5, и поэтому гистрации между указанными в .формуле вне этого диапазона (458-465 нм) нырег диапазонами выбора Л „,„,для, хл своэ6 бирать 7 „ „ нецелесообразно. Для фео с — и хл в — фео и равно 13 ни, а между диапазонами хл в — фео н н полосы регистрации интенсивности флухл а — фео а - !! нм.. Таким образом, оресценции. с учетом того же требоваесли спектральная ширина полосы возния 5 К y < i5. имеем диапазон 649 =

663 ни, а чтобы иметь достаточное

40 буждения и регистрации (по уровню

0,5) больше !2 нм, то перекрыватьудалеиие от Л "„с (хл с) слева и от ся будут .и полосы возбуждения и полосы регистрации. Поэтому целесообхл а справа, имеем окончательно воэб per разно выбирать йМ, и дЛ 5 мень"

Per !

1 диапазон h „««,(хл в, фео в) равный 45 ше !2 нм, нижнее значение этой ве653-659 ни. личины определяется в зависимости от типа прибора, на котором осущестчеи селективность системы будет больбольше9 чем в пРеДыдУщих ДвУх слУ- . 50 ше, но с другой стороны, однонременаях. итывая1 что (" ) Ho 6ypeT eHzmaTscz pHq oH z H446 йм, а 71"""„ (фео с) 429 нм, . центраций, измеряемых на выбранном

ПОЛ Ч Э В Э5 приборе, так как ухудшается соотноПОЛУЧИИу Что М макс НЕОбХОДИМО ВЫ ШЕНИЕ СИГНаЛ/Шуи бирать в диапазоне 444-448 нм !при 55 Пример выполнения

Ь" 5(444 нм мы существенно бы при веъ6 близились к 4, (фео н и хл а), Была проведена градуиронка спек"

СЬК 4„„„ (Ф трофлуориметра SLM-4800 н на нем а при 4в,,5 > 448 HM - существенно определялись концентрации пигментон

1473518

Э,„ „ 671 нм „;„; — 654 нм

М „„, 638 нм.

Система уравнений, которая использовалась. для отыскания градуировочных уравнений, имеет следующий внд: до подкисления

15 до подкисления

Р, - К„ С + К,-СЬ+ уО - Kà сч + K6 cb+ о Ка Са + К СЬ+ ь ь!

Кфьсф, К у С Фс

1 т

Кфьсфь+ К ф,Сф

3 j

КфЬСфь+ Кф с фс

К С с + КфаС фч+

С!: + Кф!!Сфч+

1 3

С„а1 4F + а 4Р + аз дР °

Сь bi dF + by4F + bp4F

1 1 з

С =с, ДР +c DF +сз4F

С !F + (F + à F — (Др

С„- b F„+ Ь Р „+ b F> - (b,4 Р

С«c,F„+ cP „+ с F >- (c, 4F

F „ — величины интенсивности .4О ! флуоресценцин исследуемо.го раствора при различных ! условиях (i=1 2,3).

F " интенсивность флуоресценцнн исследуемой пробы при

i-х условиях возбуждения и регистрации (до подкисления), F — то же после подкисления. о F !! °

С„„„„ - молярная концентрация соответствующего пигмента (пнгм =а,Ъ,с,фа,фв,фс).1

F a

К !! м (ДЛЯ ХЛОРОфиЛЛОВ

С !!егщ

55 пнгм=а,Ь,с), или у! (для феофитинов, С !и!гм пигм фа,фв,фс) " удель+а 4F +а 4F )

+ bт4Р + bз4F )

3 4 в растворах. Условия градуировки и измерения прйнимались следующими:

- длины волн максимумов возбуждения и соответственно регистрации были следующими: е

goa6

Л м кс 446 нм

- ширина полосы пропускания и по возбуждению и по регистрации (по уровню 0,5) - 8 нм; после подкисления

1 I + 1 +.

Р „- К,,С,„+ К„С„+ -К,,С„

1 / 1 + и

К фч С ф с!+ Кф ь С ф 4+ К ф с С ф с ь Ь 1 3

F „К ф

Сф- * С. + Сф (j a,b,с}

Решение этой системы

- размер кюветы в плоскости измерения 1 см 1 см; объем пробы 4 мл; — пробы подкислялись тремя каплями раствора соляной кислоты (рН

= 0,7);

- время между подкислением и и5мерением составляло не менее 3 мин. ная интенсивность флуоресценцни пигмента при i;-x условиях измерения. а 1 - с; - коэффициенты градуировоч-! ных уравнений (XI),ïîëóчаемые рипением системы (1} относительно неизвестных С „ „ после подстановки в (1) 18-ти измеренных коэффициентов К пн!м °

Проведя градуировку прибора, т.е. определив удельную интенсивность флуоресценции пигментов при всех трех условиях измерения (К !!, !,„ )-,- вычис-. ляли,коэффициенты а; - е ; системы (XI).. Чтобы определить концентрации пигментов в исследуемой пробе (С „„,„ ) мгм у для этой пробы измеряли трижды (при трех различных условиях возбуждения и соответственно регистрации) интен 9 14735 сивность флуоресценции пробы до (F, ) и трижды после подкисления (F ) ее каплями соляной кислоты. Подставляя

1 значения Р и.. CIF в систему (II), и вычисляли концентрации пигментов в пробе.

Результаты градуировки приведены в табл.2 и 3, Для контрольных растворов чистых пигментов и их смесей в рабочем диапазоне концентраций отличие между .значениями концентраций для всех хлорофиллов, фео а и фео в, определенными описанным флуоресцентным спо- 15 собом, и их истинными значениями, составляет менее 57., а для фео с ме- нее 8,5Х, Таким образом, предлагаемый способ более точен, чем известные, так 20 как, во-первых, ошибка определения каждого пигмента меньше, чем у предыдущих, во-вторых, способ работоспособен и эффективен.в общем случае любого соотношения между хл а,s,ñ н фео а, в,с, т.е. применим для любых природных вод.Кроме того, предлагаемый способ прост с точки зрения приборной реализации, так как поэволяет использовать не только спек-, З0 трофлуориметры, но и флуорнметры.

Таблица 1

Иаксимумы поглощения и флуоресценции фо- . тосинтетических пигментов в 90Х-ном ацетоне

Пигмент

Поглощение Флуоресценция ма с

Л .,нм м«кс

3 к,нм хл а фео а, фео в хл с фео с

432

411

436

446.

429

671

674

654

659

639

659

Формула изобретения

Способ определения концентрации хлорофиллов a,â, с, и их феофитинов, включающий приготовление экстракта пигментов в 90Х-ном водном ацетоне, возбуждение и регистрацию интенсивности флуоресценции до и после. под-. 40

18 10 кисления раствора, причем измерение интенсивности флуоресценции до подкисления проводится при трех различных условиях регистрации, расчет концентрации пигмента по величине интенсивности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за .счет выбора оптимальных условий возбуждения и регистрации н расширения круга анализируемых объектов, возбуждение флуоресценции раствора до подкисления проводится при

1 трех различных условиях возбуждения, возбуждение и регистрация флуоресценции после подкисления проводится при тех же условиях, что и до подкисления, причем условия возбуждения и регистрации устанавливаются так, чтобы удовлетворялось неравенство для хлорофиллов а и в: 5 «< Р /Р„ !5, и для хлорофилла с: 50 Р„(Р „ «с 150, где F() и F „ интенсивность флуорес ценции чистых пигментов до и после подкисления), прн этом первый раз при измерении интенсивности преимущественно пары хлорофилл а - феофитин а длину волны. максимума возбуждения устанавливают в диапазоне 430440 нм, а соответствующую ей длину волны максимума регистрации интенсивности флуоресценции в диапазоне

670-676 нм, второй раэ при измерении преимущественно пары хлорофилл вфеофнтин в — соответственно в диапат зонах 460-465 нм и 653-659 нм, тре-.. тий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с — феофитин с " соответственно в диапазонах 444448 нм и 636-640 нм.

)2!

4735)8

Та блица 2

Удельная интенсивность флуоресценцин

° а Ю 4ЮМаВ

1 Т э

Пигмент К нцгм, < ацгм отн. ед./ нИ

1 2

Таблица 3

Коэффициенты градуировочные уравнений !О :aN/отн.ед.

443 6озб. ню фео .а хл в фео в кл с фео с а;

Ь; с! а(Ь

3 с

8,24

15,6

64,7

I5 1

6,89

° ф

89)

1,34

- 5,46

- 794

2490

0,990

0,522

95,8

14.9

43,2

1,35

586

- 94,0 — 60900 !

" 66300

1,12

О, I )9

)8,3

7,02 !

62 !,46

- )94

335

649

- 20300.

l00000

118000!

473518

70ЮО

Fy Ю/7О К C

yuud

5080

Ур .уК /л

Со став итель О. Б адтиева

Редактор В.Фельдман Техред И.Верее Корректор Л.Зайцева

Подписное

Тираж 511

Заказ 156

ВНКИПИ Государственного комитета по изобретениям и открмтиям нри ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Рауюская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина,301