Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине ,в частности, к синтезу сорбентов для анализа низкомолекулярных гидрофобных соединений в биологических жидкостях методом жидкостной хроматографии. Целью изобретения является повышение разделительной способности сорбента и упрощение его получения и использования. Способ модифицирования исходного кремнеземного носителя заключается в последовательной обработке кремнезема γ-глицидоксипропилтриэтоксисиланом в водном растворе, п-толуолсульфохлоридом в диоксане, дипептидом формулы глицин-L-лейцин и окончательной обработке папаином для гидролиза доступных пептидных связей. 1 табл., 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ1478112

А1 14 Я(("113 Ъ .4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4248473/31-26

l(22) 25.05.87 (46) 07.05.89. Бюл. 1"- 17 (71) ИГУ им, M.В.Ломоносова (72) А.А.Сердан, А.Г.Ляшенко, А.В.Гайда, С.M,ÑòàðoBåðoâ и Г,В.Лисичкин (53) 661.183(088.8) (56) Патент США Р 4544485, кл. В 01 D 15/08, 1985..(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ

РАЗДЕЛЕНИЧ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИЩКОСТЕЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии при умеренном давлении, в частности к получению химически модифицирован- ных кремнеземных сорбентов для ВЭЖХ, и может быть использовано для определения низкомолекулярных гидрофобных примесей (например, лекарств) в биологических жидкостях.

Целью изобретения является повышение разделительной способности сорбента по лекарственным препаратам и их метаболитам, Пример 1. 10 г силикагеля

Силасорб Si-300 (ЧССР) со средним диаметром пор 10 нм и частицами размером

15 мкм с гидроксилированной поверхностью помещают в 0,1 М натрий-ацетатный буферный раствор (рН 5,65) и нагревают на водяной бане до 95 С при медленном перемешивании механической (51) 4 G 01 N 30/48 В 01 J 20/10 синтезу сорбентов для анализа низкомолекулярных гидрофобных соединений. в биологических жидкостях методом жидкостной хроматографии. Целью изобретения является повышение разделительной способности сорбента и упрощение его получения и использования.

Способ модифицирования исходного кремнеземного носителя заключается в последовательной обработке кремнезема т-глицидоксипропилтриэтоксисиланом в водном растворе, п-толуолсульфохлоридом в диоксане, дипептидом формулы глицин-L-лейцин и окончательной обработке папаином для гидролиза доступных пептидных связей. 2 ил., 1 табл. с мешалкой. Суспензию заливают 15 мл перегнанного у-глицидоксипропилтриэтоксисилана и перемешивают смесь притой же температуре 1 ч. Затем продукт отмывают на стеклянном фильтре водой и кипятят при перемешивании 1 ч в

0,01 М соляной кислоте для образования диольных групп вместо исходных эпоксидных. Полученный диольный сор- Я бент отмывают водой до нейтрального рН, промывают ацетоном, эфиром и

200 мл абсолютного диоксана. Помещают . сорбент в реакционный сосуд, снабженный мешалкой.

10 r предварительно очищенного и высушенного п-толуолсульфохлорида растворяют в 10 мл абсолютного диоксана и, добавив 15 мл абсолютного пиридина, заливают в реакционный сосуд с промытым в диоксане сорбентом. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, 1478112 осторожно перемешивая. Полученную активированную гликофазу промывают на стеклянном фильтре 350 мл диоксана для удаления непрореагировавших ос5 татков реакционной смеси, сушат и промывают карбонатным буферным раствором (0,15 М, рН 8,5).

0,6 r глицин-L-лейцина растворяют в 10 мл того же буферного раствора и добавляют туда активированную гликофазу. Выдерживают при осторожном перемешивании и при комнатной температуре 2 ч, после чего модифицированный кремнезем отмывают на стеклянном фильтре от непрореагировавшего дипептида и обрабатывают 1 М трис-НС1 буферным раствором (рН 8,8) в течение 1 ч.

0,5 гидрохпорида цистеина растворяют в 10 мл дистиллированной воды 20 и доводят рН до 5,3 0,1 M KOH. Помещают в приготовленный раствор тщательно отмытый водой модифицированный кремнезем и снова доводят рН до 5,3.

Прибавляют 5 мл .раствора, содержащего 25

0,5 г папаина, и выдерживают при перемешивании 1,5 ч при комнатной температуре. Полученный таким образом сорбент промывают на стеклянном фильтре водой, 300 мл этанола и су" 30 шат, Пример 2. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют силикагель КСК-2 с размером частиц 15 мкм.

II р и м е р 3. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют силика40 гель Силасорб Si-600 с размером частиц

10 мкм.

На фиг. 1 (А и Б) и 2 приведены хроматограммы биологических жидкостей на образцах сорбента, полученного предлагаемым способом, На фиг.1А показано хроматографическое разделение антиконвульсантов в человеческой плазме при прямом вводе на колонку с Силасорбом Si-600 (размер частиц 10 мкм), обрабЬтанным

59 по предлагаемому способу, размер ко лонки 50 х 5 мм: 1 - белки человеческой плазмы, 2 — фенобарбитал, 3.— карбамазепин, 4 — фенитоин; на фиг. 1b — хроматографическое выделе55 ние фенобарбитала из человеческой слюны при прямом вводе на колонку с Силасорбом Si-300 (размер частиц

15 мкм), обработанным по предлагаемому способу: 1 — белки человеческой слюны, 2 — фенобарбитал. Подвижная фаза — 0,01 М трис-(гидроксиметил)аминометан + 0,2 M фосфатный буферный раствор (pH /,10), рчсход 1 мл/

/мин, детектор — УФ (254 нм), объем образца 25 мкл.

На фиг. 2 показано хроматографическое выделение тилозина из культуральной жидкости его продуцента (образец отфильтрован от взвесей) при прямом вводе на колонку с КСК-2, обработанным по предлагаемому способу, размер колонки 50х5 мм: 1 — белки из культуральной жидкости, 2 - тилозин, 3 — подвижная фаза — вода 25Х + этанол 75/, расход 0,5 мл/мин, детектор—

УФ (280 нм), объем образца 25 мкл.

Пример 4. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но

1-глицидоксипропилтриэтоксисилан добавляют в холодный ацетатный буферный раствор с pl- 5,4, затем туда помещают силикагель и нагревают на водяной бане при перемешивании.

Хроматографические характеристики сорбента соответствуют .хроматографическим характеристикам сорбента по примеру 1.

Пример 5. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но вместо абсолютированного диоксана используют абсолютированный тетрагидрофуран, а вместо пиридина — триметиламин.

Характеристики сорбента аналогичны хроматографическим характеристикам сорбента, полученного по примеру 1.

Пример 6. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но вместо гидрохлорида цистеина используют раствор 2-меркаптоэтанола в ацетатном буферном растворе.

Характеристики сорбента аналогичны характеристикам сорбента по примеру 1.

В таблице даны сравнительные характеристики сорбентов по известному и предлагаемому способам.

При использовании сороента по предлагаемому способу наблюдается полное разделение лекарственных препаратов (фенобарбитал, фенитоин, карбамазепин) при анализе образцов плазмы. При этом за счет повышении разделительной способности сорбента, полученного по предлагаемому способу, удается приме нить более .крупные частицы для запол1478112

Параметры предлагаемому

Нефильтрованная плазма пациентов

Нефильтрованная плазма пациентов

Глицин-L-фенилаланин

250 х 4,0

12

УФ (254 нм) Образец

Глицин-Ь-лейцин

Привитый пептид

Размер частиц, мкм

Колонка, мм

Давление, бар

Расход ПФ, мл/мин

Время, мин

Объем пробы, мкл

Детектор

50 х 5

11

УФ (254 нм) «ения колонки и значительно сократить

1 длину колонки, что приводит к сни" жению давления на входе в систему и к возможности использования относи5 тельно простого оборудования для жидкостной хроматографии при умеренном (до 50 бар) давлении. Кроме того, при применении частиц большого диаметра и стеклянных колонок применим 1р

"сухой" способ набивки колонок, также снижающий стоимость изготовлення и применения полученного сорбента.

Формула из о брет ения 1б

Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией, включающий последовательную обработку кремнезе" ма с диаметром пор 6-10 нм растворами т-глицидоксипропилтриэтоксисилана, органического активирующего вещества, пептида и фермента, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения разделительной способности сорбента по лекарственным препаратам и их метаболитам, обработку г-глицидоксипропилтриэтоксисиланом проводят в водном буферном растворе, в качестве активирующего вещества используют и-толуолсульфохлорид в абсолютированном растворителе в присутствии органического основания, в качестве пептида используют глицин-L-лейцин, а .в качестве фермента — папаин.

1478112

0 2

Составитель Т.Чиликина

Редактор С.Пекарь Техред Л. Олийнык Корректор С. Черни

Подписное

Заказ 2356/43 Тираж 790

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101

Ч б 8 f0

Вреди

Фиг. 1

О 4 8 12 18 дреня, чин

Юог.2