Способ оценки токсического действия химических веществ, содержащихся в водной среде

 

Изобретение относится к водной токсикологии, в частности к способу оценки токсичности с использованием в качестве тест-объектов подвижных микроводорослей. Цель изобретения - повышение точности оценки и сокращение длительности анализа. Оценку физиологического состояния организмов осуществляют по скорости движения и подвижности клеток в популяции с вычислением показателя энергозатрат популяции на движение клеток. Движение микроводорослей измеряют в реальном масштабе времени методом корреляционно-доплеровской спектроскопии, для чего суспензию облучают когерентным светом с длиной волны 632,8 нм в красном диапазоне и регистрируют флуктуации рассеянного движущимися клетками света. Инкубацию тест-объекта с токсикантом проводят при температуре 25-32°С в течении 30-100 мин, а о токсическом эффекте судят для концентраций химических веществ, при которых наблюдается вторая фаза чувствительности, проявляющаяся в увеличении энергозатрат популяции на движение клеток. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1482887 (5D 4 С 01 N 33/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к двтоеском свидктельствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4260249/30-13 (22) 10.06.87 (46) 30.05.89. Бюл. N - 20 (71) Украинский научно-исследовательский институт разведения и искусственного осеменения крупного рогатого скота (72) А,А.Бегма, В.В.Власенко, В.И.Мацкивский, Ф,M,Ïåíüêîâ, Ю.И.Посудин и Г.В.Фролов (53) 654(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1184541, кл. А 61 К 31/52, 1985. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ВОДНОЙ СРЕДЕ (57) Изобретение относится к водной токсикологии, в частности к способу оценки токсичности с использованием в качестве тест-объектов подвижных

Микроводорослей. Цель изобретения— повышение точности оценки и сокращеИзобретение относится к водной токсикологии, в частности к способу оценки токсичности с использованием в качестве тест-объектов подвижных микроводорослей, и может быть использовано в системе мониторинга и контроля качества воды, в том числе при сбросе сточных вод промышленных предприятий, поверхностного стока при ме-, лиорации и в других областях, где требуется контроль качества водной среды.

2 ние длительности анализа. Оценку физиологического состояния организмов осуществляют по скорости движения и подвижности клеток в популяции с вычислением показателя энергозатрат популяции на движение клеток. Движение микроводорослей измеряют в реальном масштабе времени методом корреляционно-доплеровской спектроско" пни, для чего суспенэию облучают когерентным светом с длиной волны

632,8 нм в красном диапазоне и регистрируют флуктуации рассеянного дви;жущимися клетками света. Инкубацию тест-объекта с токсикантом проводят при 25-32 С в течение 30-100 мин, à а о о токсическом эффекте судят для концентраций химических веществ, при ко" торых наблюдается вторая фаза чувст" вительности, проявляющихся в увели- С „ чении энергозатрат популяции на движение клеток. 2 з.п.ф-лы, 4 ил., 3 табл.

Цель изобретения — повышение точности оценки и сокращение длительности анализа.

Поставленная цель достигается тем что определение токсического действия химических веществ проводят послЕ инкубации тест-объекта с химическим веществом в течение 30 — 100 мин. -

А далее суспензию клеток облучают когерентным светом в красном диапазоне с длиной волны, например, 632,8 нм с измерением флуктуаций рассеянного

1482887 движущимися клетками света, по которым определяют корреляционную функцию амплитуды рассеянного излучения и оценивают скорость и число подвижных клеток, а относительную величину энергозатрат на движение клеток в популяции вычисляют по формуле

V2 l ll

10 где v u v « средняя скорость по ано k ,самблю клеток микроводорослей .в зоне наблюдения соответственно

t5 в опыте и контроле, мкм/с;

1 и — отношение числа подвижо ных клеток в популяции к числу неподвижных соответственно в опыте

20 и контроле, при этом о токсическом эффекте судят по концентрации химических веществ, при которых наблюдается вторая фаза чувствительности, которая проявляется 25 в увеличении энергозатрат популяции на движение микроводорослей.

То, что инкубацию биологического тест-объекта с химическим веществом проводят в течение 30-100 мин, обес- 30 печивает реализацию краткосрочного контроля химического загрязнения водной среды, т.е. оперативность акали за. За это время организмы тест-объекта изменяют только энергетические характеристики своего состояния, а параметры, отражающие информационные потоки (в генетическом аппарате и др.)„ не успевают отреагировать.

Требования на длительность повреж- 40 дающего воздействия в этом аспекте можно представить в виде где t, — длительность опыта; со хара терное время развития 45 полного цикла жизнедеятельности тест-объекта (для микроводорослей это время составляет 12-24 ч }.

Данное ограничение обеспечивает повышение точности и воспроизводимости анализа, так как позволяет исключить влияние медленных циклов жизнедеятельности организма в реакции на химическое воздействие. При длитель55. ностях сравниваемых или больших характерных времен необходимо учитывать все параметры жизнедеятельности организма, а это на практике осуществить очень сложно.

То, что после инкубации облучают орг анизмы в популяции микроводорослей когерентным светом с длиной волны в красном диапазоне, например 632,8 нм, обеспечивает повышение точности оценки скорости движения клеток микроводорослей методом доплеровской спектроскопии, Зондирование пучком света позволяет проводить исследование в камере, размеры которой по габаритам в принципе не ограничены, с одним лишь условием — толщина камеры должна быть не более 0,8 — 1 мм. Это обеспечивает воэможность анализа скорос" ти движения клеток достаточно длительное время (до 1 ч) без учета фактора ограничения объема -суспензии, который в других случаях, в частности при анализе под микроскопом, необходимо обязательно учитывать. Это

I снижает вероятность получения артефактов, что также повышает точность измерения подвижности клеток в популяции. Толщина камеры менее 0,8 мм ограничивается эффектами пристеночного плавания клеток, которые влияют на скорость и подвижность клеток, а толщина больше 1 мм ограничивается тем, что для измерения флуктуаций рассеянного света использован принцип оптического гетеродинирования с помощью блика света от передней стенки камеры. Выбор длины волны света в .

Ф красном диапазоне обусловлен тем, что для водорослей рода Dunaliella

Teod в этом диапазоне не наблюдаются активационные эффекты ни в фотосинтетическом аппарате клеток водорослей, ни в пигментной системе, ответственной за явления фототаксиса. Это практически исключает эффеты синергизма, а значит, обеспечивает высокую точность оценки состояния .водорослей по параметрам их движения.

То, что измеряют флуктуации рассеянного движущимися клетками света, обеспечивает измерение скорости движения микроограннзмов методом доплеровской спектроскопии при низких требованиях к стабильности параметров как источника излучения, так и измерительного тракта. Для этого достаточно, чтобы характерные времена изменения параметров системы были не соизмеримы с характерными временами

5 14828 доплеровского сдвига на микроорганизмах (временами спадания корреляционной функции), которые имеют порядок величины в пределах 1-10 мс. Таким образом, прием измерения корреляцион5 ной функции методом доплеровской спектроскопии в целом повышает точность оценки состояния биологического тест-объекта. 10

То, что из корреляционной .фукнкции получают скорость и число подвижных клеток, обеспечивает объективный анализ состояния популяции. Корреляционная функция имеет быстро и медленно 15 спадающие слагаемые.

Параметры быстро спадающего слагаемого связаны с величиной средней по ансамблю скорости движения микроорганизмов, а относительный вес мед- эп ленно спадающего слагаемого определяет относительное количество неподвижных клеток. Эти параметры извлекаются по методу наименьших квадратов.

Таким образом, анализ состояния 25 популяции методом корреляционно-доплеровской спектроскопии в условиях автоматизации съема и обработки информации о скорости и подвижности клеток исключает субъективизм оценки. Зп

Причем величину погрешности можно уменьшить путем увеличения объема выборки (количества экспериментов) .

Реальное время съема и обсчета информации составляет 1,5-2,0 мин.

То, что при анализе состояния популяции в краткосрочных опытах используется показатель в виде v .$ обеспечивает оценку энергозатрат на движение клеток в популяции, так как и кинетическая энергия движеьия клеток и энергия, расходуемая на вязкое трение, пропорциональна v а .прямо пропорциональна количеству двигающихся клеток. Величина энергозатрат отражает свойство популяции обмениваться энергией с внешней средой и в этом проявляется фундаментальность оценки состояния биосистемы по данному параметру. Исследования показали что именно показатель энергозатрат наиболее информативен по сравнению как с характеристикой скорости, так и с подвижностью клеток. В частности, установлено, что в некоторых случаях изменения скорости при воздействиях повреждающих факторов не наблюдалось, а подвижность имела существенную вариабильность и наобо87 6 рот. Энергозатраты при этом изменялись закономерно с проявлением всех фаз стресса и адаптации. Таким образом, использование показателя энергозатрат при оценке токсического действия химических веществ на популяцию движущихся клеток — принципиально новый признак, который ранее в таком виде нигде не рассматривался.

То, что относительную величину энергозатрат на движение клеток в популяции вычисляют по формуле

VД т 2 yj обеспечивает воспроизводимость результатов оценки, так как при этом в относительном показателе энергозатрат учитываются возможные изменения, физиологического состояния исходной культуры микроводорослей, имеющие характерные изменения при развитии популяции в процессе их культивирования, при этом также повышается точность измерения.

То, что о токсическом эффекте дей" ствия химических веществ судят по концентрациям, при которых наблюдает" ся вторая фаза чувствительности, проявляющаяся в увеличении энергозатрат

1 популяции на движение микроводорослей, обеспечивает точность оценки повреждающего воздействия..Это связано с тем, что характер реакции популяции движущихся организмов при действии повреждающего фактора (исследовались температурные и химические воздействия) изменяется в зависимости от интенсивности воздействия, при этом наблюдается первая фаза стимуляции с максимальной параметрической чувствительностью, фаза "индиферентности" с минимальной чувствительностью к действию внешнего фактора,.после которой снова повышается (вторично) параметрическая чувствительность.

При этом энергозатраты относительно увеличиваются. Однако если на первой фазе снято воздействие, то биосистема возвращается в свое нормальное состояние, а при наличии второй фазы снятие воздействия не сопровождается переходом биосистемы в норму. Обычно наблюдали либо значительный гистерезис переходного процесса, либо последующую деградацию популяции (по крайней мере при тех временах наблюдения, которые исследовались в опытах) . Следует отметить, что дан1482887 ный феномен реакции биосистемы наблюдается и на других объектах.

Новым является то, что, с целью воспроизводимости опытов, измерение флуктуаций рассеянного света проводят после предварительной засветки облучающим светом н течение 1 " 2 мин.

Это связано с тем, что в первый

Момент после облучения клеток микрсводорослей за время 1 — 2 мин клетки адаптируются к режиму освещения. Установлено, что это повышает точность измерения скорости и подвижности клеток, так как ошибка уменьшается. до 15 уровня 2-5Х.

Новым также является то, что инкубацию биологического тест-объекта осуществляют при температуре в диапазоне

25 — 32 С с поддержанием стабильнос- 20 ти термостатирования не хуже «0„5 С, что обеспечивает повышение точности оценки, так как в этом диапазоне изменение параметра энергозатрат от температуры имеет однонаправленный ха- 25 рактер. Установлено, что в диапазоне

18-25 С энергозатраты уменьшаются, а при 25-32, С - увеличиваются. Известно, что диапазон 18 — 25 С соответствует для водорослей Dunaliella Teod области гомеостаза, а диапазон 25—

I О

32 С вЂ” толерантные границы физиологической активации под действием температуры для этого вида микроводорослей.

На фиг. 1 представлена блок-схема устройства для измерения энергозатрат популяции на движение микроводорослей в реальном масштабе времени методом корреляционно-доплеровской спектро40 скопии; на фиг. 2 — температурные зависимости скорости движения (А), чис" ла подвижных клеток (Ь) и энергозатрат популяции на движение (В) микроводорослей D.Salina, D.Viridis; на фиг. 3 — кинетика изменения энергозатрат популяции на движение клеток

D.Ла1ina, D.Viridis при концентраци2+ ях токсиканта Си 10 мг/л; на фиг.4дозовые зависимости реакции биологического тест-объекта на действие токсиканта в краткосрочных опытах.

Предлагаемый способ оценки токсического действия химических веществ, . содержащихся в водной среде реализуется устройством (фиг. 1) . содержа55

" щим: источник 1 когерентного излучения в диапазоне красного света, в ка честве которого использовали лазер с источником 2 питания; на выходе лазера 1 установлены диафрагма 3 и линза 4; излучение падает перпендикулярно плоскости кюветы на измерительную камеру 5, снабженную термостатирующей рубашкой, которая соединена с термостатом 6 рассеянный свет регистрируется фотоприемником 7, в качестве которого использовали фотоэлектронный умножитель, установлен-. ный под углом 16 и снабженный диафрагмой 8 и блоком 9 высоковольтного питания, выход фотоприемника 7 соединен с входом усилителя 10, выход которого соединен с входом коррелятора

11; цифровый выход коррелятора 11 соединен с входом микроЭВМ 12, из микроЭВМ 12 поступают сигналы управления работой коррелятора t1 при этом интервалы между съемами информации задаются таймером 13; выход микроЭВМ 12 соединен с цифропечатающим устройством 14.

После предварительного культивирования микроводорослей О, Salina Teod или D.Viridis Teod на питательной среде составом, г/л: NaC1 116; М880д" к7Н, О 50; 1СМО 2,5; 1С НРОа 0,2;

NaHC0 0,5; водопроводная дехлорированная вода 1 л, рН 6-7, при освещенности 6000 — 8000 лк, температуре

20 — 25 С в течение 10 — 15 дн, пробу водорослей помещают в сосуд для инкубации, куда вводят химическое вещество заданной концентрации. Если исследуемая вода с токсикантом имеет неизвестный состав, что характерно для исследования на токсичность сточных вод, то готовят ряд проб воды с различной кратностью разбавления (например, 1:1 1:2; 1:5; 1:10; 1:20;

1 50; 1:100; 1 200; 1 500; 1:1000;

1:10000) .

Инкубацию суспензии осуществляют при освещенности 6000 — 8000 лк, температуру устанавливают в пределах

25 — 32 С, предпочтительно 26 С, со стабильностью + 0,5 С, Длительность инкубации выбирают в пределах 30100 мин в зависимости от требований оперативности, например при регулировании технологического режима очистных сооружений предпочтительна длительность 30 мин.

После инкубации суспензию водорослей помещают в измерительную камеру

5, которую термостатируют до выбранной температуры, которая выше темпе1482887

I0 ратуры культивации, например 28 и

+0,5 С, с помощью термостата 6, Пучок когерентного света с длиной волны, например 632,8 им от лазера, фор5 мируют с помощью диафрагмы 3 и фокусируют в центр измерительной камеры 5 с помощью линзы 4.

После предварительной засветки облучающим светом в течение 1-2 мин рассеянный движущимися клетками микроводорослей свет и блик от передней стенки камеры 5 регистрируют фотоприемником 7, на выходе которого получают за счет гетеродинирования модулированный электрический сигнал, поступающий на вход низкочастотного усилителя 10, где происходит усиление флуктуационного сигнала до уровня 2-3В. Из сигнала с помощью корре- 2р лятора 11 строят корреляционную функцию рассеянного света в реальном масштабе времени при времени задержки

100 мкс и величине выборки (статистиьт ки) 2 -2 . Корреляционная функция 25 в виде цифрового сигнала поступает в оперативную память микроЭВМ 12.

Из корреляционной функции по методу наименьших квадратов извлекают величины скорости и числа подвижных кле- 3р ток в популяции микроводорослей, информация о которых выводится, например, на цифропечатающее устройство 14

Время между съемами информации опРеделяется с помощью таймеРа 13. Нре- 35 мя прохождения сигнала его обработки и набора статистики 2 составляет

80 с, при меньшей статистике это время уменьшается.

Величину энергозатрат на движение 40 клеток в популяции микроводорослей вычисляют по формуле

v>

W=-+--ч „ где ч и ч — средняя скорость по ансамблю клеток микроводорослей в зоне наблюдения соответственно в опыте и контроле; и „ — отношение числа подвижных клеток в популяции к числу неподвижных соответственно в опыте и контроле.

0 токсическом эффекте судят для концентраций химических веществ, при которых наблюдается вторая фаза чувствительности, проявляющаяся в увеличении энергозатрат популяции на движение клеток микроводорослей. Аналогично определяют кратность разбавления сточных вод, при которой начинается необратимый сдвиг в функциональной активности микроводорослей, что происходит при,достижении второй фазы увеличения энергозатрат популяции на движение организмов.

II р и м е р 1 (обоснование выбора предварительной засветки облучающим светом).

Суспензию микроводорослей облучают лазерным светом в красном диапазоне, при этом величина скорости движения клеток практически не изменяется, а подвижность после незначительного увеличения уже к третьей минуте стабилизируется.

В табл. 1 представлены результаты измерений скорости, подвижности и энергозатрат микроводорослей D,Salina в первые 4 мин после облучения красным лазерным светом (достоверность подгонок по методу наименьших квадратов не хуже 99, 91) .

Из табл. 1 видно, что для получения стабильных результатов при оценке химического воздействия необходима предварительная засветка облучающим светом длительностью 1-2 мин.

При этом стабильность энергозатрат после двух минут изменяется не более

7Х, а в первые минуты засветки она изменяется до 403. Нормировку для энергозатрат проводили по средней величине текущих значений, соответствующих временам 2,5; 3,0, 3,5 и 4,0 мин. где данный показатель стабилизировался.

Пример 2 (обоснование выбора температурного режима инкубации суспензии и проведения измерений энергозатрат популяции на движение) .

Исследовали температурные зависимости измеряемых показателей для двух видов микроводорослей — D.Salina (Teod), 0.Viridis (Teod). Для этог(Г пробу водорослей помещали в измерительную камеру, которую термостатировали при заданной температуре в о, пределах 18 — 60 С. При этом водоросли выдерживали для каждой температуры в течение 2 мин. Контроль скорости, подвижности клеток и энергозатраты популяции проводили в 3-кратной

<7 повторности при статистике 2 ° Ошибка по трем опытам изменялась в зависимости от температуры.

1482887

Е табл. 2 представлены величины погрешности дпя скорости и подвижности клеток, а на фиг. 2 показаны температурные зависимости; 2.А — для скорости движения, 2.Б — подвижности клеток и 2, — величины энергозатрат популяции на движение клеток микроводорослей (кривая 1,3 и 5 — D.Salina; кривая 2,4 и 6 — D.Viridis).

Из табл, 2 следует, что погрешность в опытах по температурным исследованиям в области выбранных режимов термостатирования (заштрихованная область на фиг. 2) не превышает

41 для скорости движения и 81 дпя подвижности.

Как видно из температурных зависимостей, в диапазоне 25 — 32 С наблюдается синбадность изменения скорости движения, подвижности клеток и величины энергозатрат популяции на движение клеток микроводороспей, При этом дпя показателя энергозатрат характер изменения разных видов водорослей полностью совпадает.

Если инкубацию проводить при температурах меньше 25 С, то в этом случае возможны эффекты инверсии в реакции движения микроводороспей, что повышает ошибку измерения, так как эти явления зависят от физиологического состояния исходной культуры.

Очевидно, что учет их — задача сложо ная. При температурах выше 32 С необходимо учитывать повреждающее воздействие температуры, которое на фоне химического воздействия может либо усиливаться, либо уменьшаться, что также влечет эа собой увеличение динамической ошибки.

Таким образом, при температурном диапазоне 25 — 32 С ошибки измерения имеют минимальные значения.

Пример 3,(установление дли1 тельности проведения опыта при оценке токсического действия химических веществ на микроводоросли D.Salina

Teod или D.Viridis Теос1).

Пробы микроводорослей инкубировали при 26 С в присутствии токсикантов, после чего измеряли скорость движения и подвижность клеток популяции с последующим вычислением энергозатрат популяции на движение клеток микроводорослей. На фиг. 3 представлены в качестве примера результаты экспериментов действия токсиканта, где график 1 отображает кинетику

40 рациях имеет фазу стимуляции, при средних — некоторое ингибирование, при больших появляется вторая фаза стимуляции и при очень больших наблюдается деградация жизнедеятель45 НосТН клеток установлено что IIpH достижении первой фазы стимуляции после снятия воздействия параметры энергозатрат восстанавливаются до нормы (контроля), а при достижении второй фазы такого восстановления не

50 наблюдали даже через 24 ч. Поэтому о токсическом эффекте химического воздействия необходимо. судить только для концентраций, при которых наблюдается вторая фаза стимуляции. Это свойство реакции биологического тестобъекта характерно и для других исследованных химических веществ.

Использование данного критерия оцен5

1О

35 реакции микроводорослей D.Salina Teod I Ф на Си в концентрации 10 мгл/л, а график 2 - микроводорослей D Viridis Teod на тот же токсикант. Достозерность подгонок по методу наименьших квадратов не хуже 99,9/. Как видно из фиг. 3, в интервале 30 — 100 мин водоросли изменяют свои параметры достаточно, чтобы сделать вывод о токсическом действии, Следует отметить, что именно параметр энергозатрат наиболее информативен, так как кинетика его изменения имеет характерные фазы перестройки популяции под действием токсиканта с этапами стимуляции, ингибирования и повреждения клеток. Длительность инкубирования более 100 мин ограничивается требованием экспрессности контроля, а менее 30 мин — величиной ошибки в динамике и требованием завершения фазы перестройки стимуляции.

В табл. 3 представлены значения дисперсии измеряемых величин в динамике в токсикологическом опыте.

Пример 4 (обоснование критерия токсического эффекта в краткосрочных опытах с использованием подвижных клеток микроводорослей) .

Инкубацию микроводорослей D,Salina Teod проводили при 26 С в течение

30 мин при освещенности 8000 лк в

2+ присутствии, например, ионов меди Си и тритона Х-100. Результаты представлены на фиг, 4 (график 1 — для меди, график 2 — для тритона Х-100). Из дозовой зависимости видно, что параметр энергозатрат при малых концент13

1482887 ки токсического действия позволяет количественного контролировать химическое загрязнение в краткосрочных опытах.

Предлагаемый способ оценки токсического действия химических веществ, содержащихся в водной среде, может быть реализован на любой другой установке, которая позволяет получать ин- 10 формацию о скорости движения и подвижности клеток в популяции в реальном масштабе времени методом корреляционно-доплеровской спектроскопии.

Использование способа наиболее эф- 15 фективно в задачах оперативного контроля качества водной среды методом биотестирования в связи с особой важностью решения проблемы охраны окружающей среды, в частности водных 20 экосистем, кроме того, при органиэации скрининга вновь синтезируемых химических веществ, например в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой и химической промышлен- 25 ностях. Особое значение использования данного способа имеет при оценке состояния водных систем в экстремальных ситуациях антропогенного воздействия, 30

Использование предлагаемого способа оценки токсического действия химических веществ, содержащихся в воднои среде, обеспечивает по сравнению с существующими способами измерение флуктуаций рассеянного света движущимися клетками микроводорослей методом корреляционно-доплеровской спектроскопии, позволяет с большой точностью оценить скорость и подвижность 40 клеток в популяции, что дает возможность получать величину энергозатрат популяции на движение организмов в реальном масштабе времени при оценке токсического действия химических веществ методом биотестирования в краткосрочных опытах; наличие большой статистики выборки при анализе рассеянного света движущимися организмами позволяет получать статически достоверные сдвиги энергозатрат на популяционном уровне при исследованиях токсических эффектов, на гидробионтах, Ф о р му л а и з о б р е т е н и я

1. Способ оценки токсического действия химических веществ, содержащихся в водной среде, включающий культивирование подвижных микроводорослей рода Dunaliella Teod, ввод токсиканта в пробу с биологическим тест-объектом и инкубацию в течение заданного времени при освещении

6000-8000 лк и стабильной температуре и последующую оценку состояния изменения физиологического состояния организмов в популяции по скорости движения клеток, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения точности оценки и сокращения длительности анализа измеряют энергозатраты популяции на движение микроводорослей методом корреляционно-доплеровской спектроскопии, для этого через 30100 мин после начала инкубации суспензию микроводорослей облучают когерентным светом в красном диапазоне с длиной волны 632,8 нм с измерением, флуктуаций рассеянного движущимися клетками света, по которым определяют корреляционную функцию рассеянного света и оценивают скорость и число подвижных клеток, а относительную величину энергозатрат на движение клеток в популяции (M) вычисляют по формуле Я- о

1 = — — о — 1к

2 гди v H v средняя скорость по ансамблю клеток микроводорослей в зоне наблюдения соответственно в опыте и контроле, мкм/с;

,и — отношение числа подвижных клеток в популяции к числу неподвижных соответственно в опыте и контроле, отн, ед., при этом о токсическом эффекте судят для концентраций химических веществ, при которых наблюдается вторая фаза чувствительности, проявляющаяся в увеличении энергозатрат популяции на движение клеток микроводорослей.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью воспроизводимости опытов, измерение флуктуаций рассеянного света производят после предварительной засветки облучающим светом в течение 1 — 2 мин.

3. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что стабилизацию температуры осуществляют в диапазоне

25 — 32 С.

1482887

Таблица 1

Динамика показателей микроводорослей D.Salina при действии лазерного света в начальный момент времени

Показатели

3,5 4,0

57,73 57,15

61, 74 60,59

52 60 51;01

58,57 60,01

44,34 45,93

60,02

60,05 46,62 46,73

1,28 1,22

1,40

1 06

0,98

0,93

1,07

Таблица2

Зависимость относительной погрешности измеряемых показателей микроводорослей от температуры

Содержание при, С

) Г (Показатели

Вид водорослей ео

20 30 40 50

Скорость движения, мкм/с

13,1 D.Salina

D.Viridis

3,6

2,0

3,2

3 5

13,7

6,2

4,1

Относительное количество подвижных клеток, % 4,6

3,8

D.Salina

0 Viridis

7,2

4,3

7,4

63,6

20,0

Та блиц а 3

Изменение относительной погрешности во времени в присутсвии токсиканта

Вид тестобъекта

Параметры

13 26 39 52 65 78 91 104 117

Скорость, мкм/с

27 19 32 20 22 22 1,2 i 7 1,5 DSalina

24 24 1,7 2,1 1 7 27 3,1 21 51 DViridis

Подвижность, %

5,4

5,2

6,0 5,6

4,7 5 8

Скорость, мкм/с

Подвижность, %

Энергозатраты, отн, ед.

Содержание через мин

1 1,5 2,0 2,5 3,0

3,6 4,3 4,7 4,2 3,8 5,4 D.Salina

3,8 3,7 4,1 4,0 4,0 6,3 D.Viridis

3482887

1482887

7,0

f,6

1,2 и8 и4

Юж м, мин ф

1 ъМ 1а

Ь

0.8

Ъ

Ъ рр

Ь)

0,Ф

g 02

Ь

Фф

Ь 0 ,ф

Р 2у,C

Иоицеророцие, p / .

Составитель О. Корженко

Редактор M.Êåëåìåø Техред М. Дидык Корректор Э.Лончакова

Заказ 2752/18 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101