Способ получения ингибитора люциферазы

 

Союз Советскмк

Соцналистнч вские

Республик

741858

1 ,/ (61) Дополнительное к авт. свна-вy (22) Заявлено 01,09.77 (21) 2513151/28-13 (И) М. К..

А 61 В 10/00

А 61 К 37/64 с присоединением заявки J%

Госудеротеенный комитет (23) Приоритет ао делан нэабретеннй н открытий

Опубликовано 25.06.80. Бюллетень J% 23

Дата опубликования описания 27.06.80 (53) УДК 616

-074 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. А. Кратасюк, B. А. Кратасюк, А. Н.,Шендеров и А. М. Фиш

Институт физики им. Л. B. Киренского Сибирского отделения

АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПСЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА JII0U ИФЕ РАЗЫ

Изобретение относится к области биохимии.

Предложенный способ является новым, в патентной и научно-технической литературе не описан.

Ileabro изобретения является получение ингибитора люциферазы.

Эта цель достигается тем, что биомассу. клеток светящихся бактерий Photo )сэД.Ег1атпразрущают, отделяют водорастто воримую фракцию, подвергают ее гельфильтрации на биогеле .с диапазоном деления по молекулярному весу 800-4000 . дальтон при скорости элюции 2-4 мл/см и за 1 ч, далее элюат. очищают на ДЭАЭ целлюлозе и получают целевой продукт.

Пример. 5 г сырой биомассы Pbatobacte <>vn р, суспендируют в 30 мл бидистиллированной воды, содержащей этилендиаминтетраацетат 10 и и дитиотрейтол 1 0 М. Полученную суспензию

-4. перемешивают с помощью магнитной мео шалки в течение 20 ч при 4 С. 3a- . тем центрируют 1 ч при 15000 об/мин.

Надосадочную жидкость хроматографируют на колонке размером 2,5х50см, заполненной биогелем Р4(диапазон деления данного биогеля по молекулярному весу 800-4000 дальтон). Уравновешивание колонки и элюцию образца осуществляют фосфатным буфером (0,05М, рН 6,2).

Скорость элюции 3 мл/см в час или с учетом сечения колонки 15 мл/ч. Скорость элюции в разных опытах может варьировать в пределах 2-4 мл/см в час.

2 2

Уменьшение скорости элюции ниже 2мл/см в час нецелесообразно, так как это увеличивает время опыта.

Увеличение скорости элюции .выше

4 мл/см в час приводит к уменьшению разрешающей способности колонки и фракция ингибитора не отделяется от побочных загрязняющих фракций.

Фракцию ингибитора, выходяэцую с колонки в объеме от 200 до 250 мл, собирают и концентрируют до 15 мл с помощью диализа на В1О- Fiber-,20, ВестК ) (Ъо1 ос1, США) против 15%ного раство4 вания 1,28. 10 ь. Очшиешп,й препарат ингнбитора при электрофорезе выявляе » ся в виде одной узкой полосы.

Предлагаемый способ позволяет получить жгибитор люциферазы, который может найти применение для определения микроколичеств веществ, таких как аденозитрифосфат, н потинадениндинуклеотил, флавинмононуклеотид, при определении многих

10 патологий.

Формула изобретени я

Способ получения ингибитора люци15 феразы, заключающийся в том, что биомассу клеток светящихся бактерий PhotobacteHurn разрушают, отделяют водорастворимую фракцию, подвергают ее гельфильтрации на биогеле с диапазоном де20 ления по л олекулярному весу 8004000 дальтон при скорости элюции

2-4 млlсм в час, далее элюат очищают на йЭАЭ-целлюлозе и получают целевой продукт.

7418:>8 ра хлористбго кальция. Полученный раствор хроматографируют на кonонке разме— ром 2,5х30 см. заполненной ДЭЛЭцеллюлозой. Колонку уравновешивают фосфатным буфером (0,05 M, pH 6,3).

Скорость элюции 3 мл/см в час (с учетом сечения колонки 15 мл-ч).

Элюцию образца проводят линейным градиентом концентрации фосфатного буфера.

-Ингибитор выходит в объеме элюата от

330 до 400 мл. В результате получаем

70 мл раствора, содержащего 1280 единиц ингибитора.

Очищенный ингибитор имеет следующий элементный состав,%: водород 1,5; углерод 1,5, фосфор + кислород 97.

Эти данные характеризуют ингибитор как вещество полифосфатной природы.

Молекулярный вес, определенный по данным гель-фильтрации, составляет

890 = 23. Кинематически ингибитор ведет себя как конкурентный ингибитор по од.— ному из субстратов люциферазы — алифатическому альдегиду, константа ингибироСоставитель С. Малютина

Редактор П. Горькова Техред М. Петко Корректор М. Пожо

Заказ 3342/2 Тираж 673 Подписное

UHHHIlH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,