Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus- продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека

 

Изобретение относится к области гибридомной технологии. Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (мон АТ) к фактору некроза опухолей-альфа (ФНО-α) человека, обладающее биохимической однородностью и высокой специфичностью. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N173Д. Штамм продуцирует мон АТ JGG1 - изотипа, связывающееся с ФНО-α человека. Содержание мон АТ в 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитной жидкости составляет соответственно 14-20 мкг и 5-7 мг. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре. Мон АТ штамма гибридомы может быть использовано для иммуносорбции Р ФНО-α, а также для очистки последнего. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П.(НТ СССР (21) 4352632/28-13 (22) 29.12.87 (46) 15.09.89; Бюл. К 34 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови, Институт молекулярной биологии АН СССР и Институт биоорганической химии им. M.М.Шемякина (72) А.В.Панютич, Н.Н.Войтенок, P.Ë.Òóðåöêàÿ, A.Н.Шахов, С.А.Недоспасов, С.А.Чувпило, Л.Н.Шингарова, В.Н.Добрынин и В.Г.Коробко (53) 578.085.23 (088.8) (56) Hirai М, et al. J.lmmunol.Meth., 1987, Ч.96, р.57-62. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS.MUSCULUS-ПРОДУ.ЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА (19) (И) (51)4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

2 (57) Изобретение относится к области гибридомной технологии. Цель изобретения — получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (мон AT) к фактору некроза опухолей-альфа (ФНО-d) человека, обладающее биохимической однородностью и высокой специфичностью. Штамм депонирован под номером ВСКК/П У 1?3D. Штамм продуцирует мон AT Ig G 1 — изотипа, связывающееся с ФНО- о(человека. Содержание мон AT в 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитной жидкости составляет соответственно 14-20 мкг и 5-7 мг.

Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в куль- . a туре. Мон AT штамма гибридомы могут быть использованы для иммуносорбции P ФНО-a а также для очистки последнего. 2 табл.

150779

Изобретение относится к гибридомн и технологии.

Цель изобретения — получение гибридного штамма, продуцирующего монокло5 н льное антитело (мон АТ) к фактору н кроза опухолей-альфа (ФНО-o() челов ка, обладающего биохимической однор дностью и высокой специфичностью.

Штамм получают следующим образом. 10

Иьппей линии ВА13/С иммунизируют по

21недельной схеме. 20 мкг Р НфО-а в

0 15М NaC1 в смеси с равным объемом п лного адьюванта Фрейнда дважды ввод т внутрибрюшинно с интервалом в : 15

7 дней. За 3, 2 и 1 день до слияния

1 мкг P ФНО-о вводят внутрибрюшинно

0,5 мл 0,15 М NaCI. Гибридизацию

1,2 х 10 клеток селезенки иммунных ппей и 4 х 10 клеток миеломы мыши

63-Ag8-653 проводят 50%-ным раствоом полиэтиленглиголя мол.массой

000, содержащего 5% .диметилсульфоксиа, в течение 1,5 мин. После гибридиации и отмывки клеток от полиэтиленликоля клетки высевают в 96-луночные цанели по 1 х 10 спленоцитов в лунку. ля культивирования и селекции гибидом используют среду ЩДМ (моцифи цированная Iskove S среда Дульбекко) добавлением 10%ной эмбриональной те.лячьей сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 х 10 М аминоптерина и 1,6 х 10 М тимидина. Гибриды-продуценты клониру 0т 2 раза методом конечных разведений 35

ысевая по 1 клетке в лунку, содеращую 4 х 10 клеток селезенки. После клонирований практически l00% сублонов продуцируют мон AT к Р ФНО-с . продукция антитела сохраняется как 40 минимум в течение 15 пассажей в культуре.

Гибридома получила условное название 13D10, штамм депонирован под номером ВСКК(П) 173D. 45

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования, Среда INDN с 10% донорской телячьей сыворотки, 2х10 4 N глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05х10 N меркаптоэтанола, 37 С, атмосфера 5%-ного СО .

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза 100200 тыс.клеток/мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6- 1:8, культура суспензионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны

1 4 мыши BALB/Ñ. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5х10 клеток/мл среды IMDN. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклонального антитела на "-3-й день культивирования составляет 14-20 мкг/мл культуральной среды и 5-7 мг/мл. асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное антитело IgG1 Специфичность—

НФО-и4.

Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание мон AT с иммобилизированным ФНО-Ы (иммуноферментный анализ).

Антиген сорбируют на пластине:

500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,б, в течение ночи при

4 С. После отмывки наносят, тестируемую культуральную среду, после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител меченными пероксидазой кроличьими антимышиными антителами. Все отмывки проводят бидистилированной водой. Контролем служит бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве антигена, Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживавт в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида.

Режим замораживания: 1 С/мин до -70 С.

После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяо ной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 55-60% по окрашиванию трипановым синим.1

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре. не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на

ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Пример 1. Тест на определение специфичности взаимодействия мои

AT с антигенами, иммобилизованными на пластине Р ФНО-с1, Р ФНО- и БСА. в количестве 0,5 мкг в 50 мйл 0,1 М карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбируют в течение ночи при 4 С. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл

1507791

Кроличья антисыворотка

1:5000

А492 «10з

Антигены

Культураль ная среда штамма

13D10

А492«10

115

291

БСА

2509

2584 ФНО-а

154

481. ФНО-Д

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности мон AT вырабатываемого клетками штамма 13D10, и показывают возможность применения этого 45 мон AT для определения P ФНО- o(с помощью иммуно-ферментного метода. Высо" кая константа аффинности мон AT штамма 13ИО создает дополнительные преимущества при использовании в иммуноферментном анализе.

Пример 2, Сорбция P ФНО- мон AT штамма 13D10. К 1 мл Spa-сефарозы 4В добавляют 1 мл кроличьей анTHcblBopoTKH к иммуноглобулинам мыши и 55 инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшиеся антитела отмывают 0,05 М трис-НС1,0,15 М NaCI, рН

7,4 (ТБР), путем многократного центрикультуральной среды штамма 13D10 или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCI, 1 7 БСА (ЗРФ-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичных к Р ФНО-o(. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченные 10 пероксидазой, разведенные 1:2500 в

ЗФР-БСА, и меченные пероксидазой противокроличьи антитела 1:2500 в ЗФР-БСА.

После инкубации в течение 1 ч при о

20 С плату отмывают и в лунки добавля-15 ют субстрат — ортофенилендиамин гидрохлорид 0,6 мкг/мл в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем

0,033 Н О,. Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учи- 20 тывают на спектрофотометре с верти.кальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания мон AT, продуцируемого клетками штамма 13D10, с антигенами, иммобилизованными на плас, тине, представлены в табл.1.

Т а б л и ц а 1

Таблица 2

Сорбция мон

AT штамма

13D10

А540 х10з

Фактор некроза опухолей

До сорбции

А540 «10

Рекомбинантный ФНО- с

445

1308

Рекомбинантный ФНΠ— р

316

413

Данные этого примера свидетельствуют о специфическом связывании биологической активности рекомбинантного ФНО-Ы мон AT штамма 13D10. Таким образом, мон AT штамма 13D10 может быть использовано для иммуносорбции фугирования. С 0,3 мл полученного сорбента смешивают 5 мг сульфатной фрак( ции асцита гибридомы 13010, инкубируют на горизонтальной качалке i ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промывают ее ТБР. Образцы

Р ФНО-o(и P ФНО-в готовят на минимальной среде, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 57 ЭТС, глютамином, меркаптоэталоном, пенициллином и стрептомицином (полная среда (DMEM). 0,5 мл образца пропускают через колонку в течение 15 мин, затем собирают и стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Биологическую активность факторов определяют по лизису клеток мышиной фибробластоидной линии L929 в присутствии актиномицина. Накануне,.теста клетки L929 рассеивают по 50 тыс/лунку в плоскодонные 96-ячеечные микроплаты в полной среде ЖМЕМ. ОБразцы

ФНО раститровывают в отдельном планшете в объеме 100 мкл, затем переносят в плату с клетками Ь929, добавляют актиномицин до концентрации 1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой 37 С на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток

0,27.-ным раствором генцианвиолета в

27-ном метаноле в течение 10-12 мин.

Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучОм, Результаты опыта по сорбции P ФНО-e( мон AT штамма 13D10 представлены в табл.2.

1507791

Оптическая плотность окрашенных

1 интактных клеток составляет 1290. !

Составитель А.Маныкин

Техред М.Моргентал . Корректор О. Ф пле

Редактор Л. Пчолинская

Тираж 501

Подписное

Заказ 5516/29

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям .при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ó êãîðîä, ул. Гагарина,101 с цельй изучения биологических эффектов P ФНО-Ы, а также для его очистки а

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus ВСКК (П ) ¹ 173D — продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека.