Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител против ангиотензин- превращающего фермента из легких человека

 

Изобретение относится к ,биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологин для выявления антигена - а«гиотензин - превращающего фермента (АПФ). Цель изобретения - получение нового штамма гибридомы, продуцирующего специфические моноклональные антитела (МАТ) против АПФ из.легких человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (II) № 180Д. Секреция МАТ на 3-4-й день культивирования составляет 20-40 мкг/мл нультуральной среды и 4-6 мг/мл асцитической жидкости. МАТ относятся к AgGj подклассу и, специфически связывают АПФ из легких человека. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (5l)5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

APH ГКНТ СССР (46) 07.01. 91. Бюл, Â 1 (21) 4352832/13 (22) 30.12,87 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР и Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов

Министерства здравоохранения СССР (72) С.М,Данилов, Е.Р.Алликметс, И,IO.Ñaõàðoâ, Е.А.Духанииа, А.К.Молдобаева, Е.Н.Аточина и И.Н.Тракт (53) 578.085,23(088 ° 8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1308625, кл С 12 N 5/00, 1986, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине н биологии для выявления антигена - ангиотенэин-превращающего . фермента (АПФ).

Цель изобретения - получение но» вого штамма гибр» домы, продуцирующего специфичные моноклональные антитела (МАТ) йротив АПФ из легких человека, Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВАЬВ/С иимуниэируют .внутрибрюшинным введением 80 мкг аыгиотензин - превращающего фермента, „,80„„1496266

2 (54) ШТАК ГИБРИДНЫХ К,ЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИ

АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕ ГО ФЕРМЕНТА . ИЗ ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к „биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологии для выявления антигена — аягиотенэин — превращающего фермента (АПФ). Цель иэобретения — получение нового штамма гнбридомы, продуцирующего специфические моноклональные антитела (MAT) против

АПФ иэ легких человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (ТТ) - 180@.

Секреция MAT на 3-4-й день культиви- g рования составляет 20-40 мкг/мл . культуральной среды и 4-6 мг/мл асцитической жидкости. МАТ относятся к АяС подклассу и, специфически связывают АПФ иэ легких человека.

2 табл. выделенного иэ ткани легких человека, в 0,2 мл эабуференного фосфатами фиэиологическего раствора (ЗФР), содержащего ЗОУ. полного адъюванта

Фрейнда. Через IO дней иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно

60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта, Через неделю мышам вводят 60 икг

+ фермента внутривенно в объеме 50 мкг. т

Через 3 дня после этого 15 10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизируют с 5 ° 10 клеток миеломы мы7 ши Х63-Ag8-653 в присутствии 0.,7 мл раствора, содержащего 45Х (об,/об,) l496266 зуют против того же буфера, Полу3 полиэтиленгликоля (П .3Г) мол. массы

3350 и 15 диметилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЗГа, клетки высеваи ют в 96-луночные панели по 2 10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду

RPMI-1640 с добавлением 10 -ной лошадиной и !ОХ-ной телячьей эмбриональной сыворотки, 10 И гипоксанти-Ф на, 4 "10 М аминоптерина и 1,6 IO М тимидина. Гибриды — продуценты клонируют Z раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, 15 содержащую 4 10 клеток селезенки, Ф

После 2-ro клонирования практически

100Х субклонов продуцируют антитела к АПФ.

Полученмый штамм обозначают А-ACE- 20

ЗА5, ои хранится в специализированной коллекции церевиваемых соматических

Клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(Ы)

11 180Д и характеризуются следующими признаками.

Культуральные признаки, Стандартные условия культивирования. Для выращивания используют пластиковую посуду - среда RPMI-1640 с добавле- 30 нием 10Х-ной телячьей эмбриональной сыворотки и 10Х-ной лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 10 мМ пиру-. вата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокис» лотами для базальной среды Игла и о

0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 С в атмосфере 5Х-ной углекислоты.

Посевная доза 10-10 клеток в мл.

5 . Клежи пассируют в дозе 10-100 тыс. 40 раз в 5 дней, или в дозе 100 тыс. о и более 1 раз в 3 дня. Культура суспензионная, в микрообъемах может вы. ращиваться "как монослойная, 45

Ддя выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят s брюшную .полость мышей BALB/С, обработанных за 10 дней до инъекции пристаном, в количестве 2-5 10 клеток в 1 мл сре-50

6 ды Игла на мышь. Опухоли развиваются у мьппей через 12-16 дней. Продуктивность. Секреция MAT íà 3-4-й день культивировакия в зависимости от посевной дозы составляет от 20 до

40 мкг/мл культуральной среды.и 46 мг/мл асцитичеекой жидкости (кон.центрации определяют методом торможения иммуиоадсорбции).

Характеристика полученного продукта — штамм продуцирует моноклональное антитело, относящееся к IgG подклассу и связывает АПФ легких человека, не затрагивая его активный центр.

Специфичность взаимодействия МАТ с

АПФ выявляют в твердофаэном радиоиммунном или иммуноферментном анализах или методами, основанными на определении активности фермента, Стабильность продукции.

Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 20 пассажей в культуре, стабильная секреция сохраняется до 8-ro пассажа in vitro u при культивировании в виде асцитной опухоли.

Криоконсервирование.

Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморожены . в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10Х-ного диметилсульфсйсида. Режим замораживания -4 С в о о минуту до +4 С, затем 1 в минуту о до -40 С, затем клетки переносят в жидкий азот. Раэмораживают клетки, перенося ампулу из жидкого аэота в водяную баню на 37 С.

Контаминация.

Контаминация бактериями, грибками н микоплазмой не обнаружена, Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 ° 10 в 5 мл среды е

RPMI-1640 с 10/-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 10 -íoé лошадиной сывороткой, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,03 мМ меркаптоэтанола, клетки культивируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 . СО . Для полу6 чения асцитной опухоли 2-5 ° 1О гибридомиых клеток вводят в брюшную полость мьппей BALB/С, обработанных пристаном, Через 2-3 недели собирают асцитную жидкость, и иммуноглобулины осаждают сульфатом натрия. Осадок растворяют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCI и диаличенные антитела используют как реал гент для излучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензинпревращающим ферментом легких человека.

1496266 бент (10 мкл сорбента — S мкг ЛПФ) и 200 мкл ниэкоемкой целлюлозы.

Для уменьшения неспецифического связывания сорбент обрабатывают

0,2%-ным раствором БСЛ в ЗФГ. Через

I0-l5 мин сорбент осаждают центрифугированием, супернатант сливают.

В пробирки в объеме 250 мкл вносят иммуноглобулины в ЗФР-БСА в различной концентрации, выделенные из асцитной жидкости мышей BALB/Ñ, котоpbbs введены клетки штамма Л-ACE-ÇG8, А-ЛСЕ-5ЕI, Л-ACE-9B9, A-ЛСЕ-3A5 ° Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в эти пробирки вносят моноклональные антитела, вырабатываемые клетками штамма ЗЛ5, меченные

И5 иэотопом l с удельной активностью

300 10 срш/мкг белка антител. Чеэ рез 1 ч несвязавшиеся иммуноглобулины отмывают 0,2%-ным раствором BCA

В в ЗФР и количество связавшихся меченых антител просчитывают в счетчике радиоактивности (табл. 2) .

Результаты этого примера, представленные в таблице, однозначно свидетельствуют, что антитела, вырабатываемые клетками штамма А-АСЕ3А5, взаимодействуют с эпитопом на молекуле АПФ, отличным от эпитопов, распознаваемых антителами, вырабатываемыми клетками штаммов А-ACE-ÇG8, А-АСЕ 9В9, А-АСЕ 5FI.

Результаты приведенных примеров свидетельствуют о «ысокой специфичности связывания моноклонального чтитела, вырабатываемого клетками штамма A-ACE ЗА5, с АПФ, что может быть использовано при определении и выявлении ЛПФ как в иммобилизованном состоянии, так и в растворе. Кроме того, обнаружение еще одной антигенной детерминанты на молекуле АПФ, выявляемой антителом, вырабатываемым клетками штамма А-АСЕ-ЗА5, позволит начать работы по.антигенному картированию молекулы АПФ, что крайне saaно для исследования регуляции активности АПФ и лечения гипертонии.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(ХХ) а. Elisa метод:

На полистироловую 96-ячеечную па- . нель для микротирования сорбируют

АФП вЂ” 1 мкг на ячейку в 50 мкл карбонатного буфера (100 мМ, р11 9,6) при 4 С в течение ночи, После насыщения панели 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА), для уменьшения неспецифического свя- 10 зывания антител пластиком, в ячейки панели вносят 50 мкл асцитной жидкости штамма А-АСЕ-ЗА5 с концентрацией белка 1 10, IOO мкг/мл (1 ч, 37 С).

После этого панель отмывают 4 раза по 15

100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05%

Твин-20 и вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно связанных с пероксндаэой (2 мкг/мл, 37 С, I ч).После окончания инкубации несвяэавшиеся продукты реакции отмывают укаэанным вьппе способом, а связавшуюся пероксндазу, а значит и антитела против

АПФ определяют количественно по рас25 щеплению субстрата (Н О ) в присутствии хромогена — ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 490 нм.

Пример 2. Тест на специфичность взаимодействия МкАТ с АПФ в растворе.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют 35 антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 100 мкл на ячейку в концентрации 20 мкг/мл (4ОС; ночь), затем после забивки плашки 0,2% раствором БСА в ЗФР, для уменьшения не- 40 специфического связывания антител с пластиком, сорбируют иммуноглобулииы мыши из асцитной жидкости штамма

А"АСЕ-ÇA5, полученной как указано в примере 1 ° После отмывки панели

0,2Х раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов, в ячейки вносят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкг/мп). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-АСЕ-ÇA5, определяют количественно в ячейках для микротирования с помощью флуоресцентного метода, Результаты опыта представлены в 55 табл. 1. В 180Д вЂ” продуцент моиоклональных

Пример Э, В маленькие про- . антител, против ангиотензинпревра. бирки дпя гамма-счета вносят АПФ-сор- . щающего фермента из легких человека.

4 1496266

Таблица

Специфичность МАТ, вырабатываемых штаммом А-AGE-ÇA-5, против АПФ из легких человека

Концен- Активность трация, АПФ в ячеймкг/мп ке (флуор. отн. ед,) Асцитная жидкость

Штамм А-АСЕ-3А5 100 10

l3,92

11 22

8 64

100

l e

2,0

Таблица2

Специфичность моноклональных антител против АПФ

Связывание йз меченых антител

ЗА5 с АПФ-сорбентом (имп/мин) Концентрация неме ченых антител, мкг/мл в качестве отрицательного контроля используют ячейку с целлюлозой, в которую добавляют только меченые антитела. - в качестве положительного контроля используют ячейку с АПФ-сорбентом и целлюлозой, в которую добавляют только. меченые антитела.

° °

Штамм "8С4", вырабатывающий антитела .против липопротеидов низкой плотности из плазмы человека

0,2Х БСА в ЗФР

939 1

0,1

° 10

5Fl

0,1

l0

ЗС8

0,1

ЗА5 1

0р1

Целлюлоза . «13А5

2664

3129

4421

5493

5672

2688

4556

4918

297

1283

3927

4505