Штамм культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Цель изобретения - получение штамма, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде. Штамм LEBR 1/1 - SF получен в результате селекции трансформированных фибробластов подкожной соединительной ткани линии L на устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этидия и характеризуется свойствами, присущими клеткам мышиного происхождения. Штамм LEBR 1/1 - SF депонирован под номером ВСКК(П) N Д107. Клетки штамма способны к длительному размножению в среде без сыворотки, что обусловлено способностью клеток синтезировать собственные ростстимулирующие факторы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1495374 () С 12 М 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н д BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ i8 »; L3 °

1 I

f

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4336184/28-13 (22) 30. 11. 87 (46) 23.07.89. Бюл. М 27 (71) Институт цитологии АН СССР .(72) В.А.Плескач, Т.Н.Игнатова, М.В.Тарунина, И.В.Кожухарова, Е.В.Березкина и И.В.Арцыбашева (53) 578.085.23(088.8) (56) Rathgen et al. Hybridoma, 1986, 5 (3), р. 255-263. (54) ШТАМ1 КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ

РОСТСТИМУЛИРУКЮ(ИХ ФАКТОРОВ ГИБРИДОМ (57) Изобретение относится к гибри.домной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцируюИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих монокло" нальные антитела, применяемые в сельском хозяйстве, медицине и микробиологической промышленности.

Цель изобретения — получение штамма клеток, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде.

Штамм получен в результате селекции трансформированных фиброг.пастов подкожной соединительной ткани линии

L устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этидия концентрации 1 мкг/мл и последующего субкультивирования в среде без селектив;:щих моноклональные антитела. Цель изобретения — получение штамма, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде. Штамм .еЬг 1/1-Б1получен в результате селекции трансформированных фибробластов подкожной соединительной ткани линии L на устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этидия и характеризуется свойствами, присущими клеткам мышиного происхождения, Штамм .еЬг 1/1-Sf. депонирован под номером ВСКК(П)

У Д107. Клетки штамма способны к длительному размножению в среде без сыворотки, что обусловлено способностью а

Щ клеток синтезировать собственные ростстимулирующие факторы. 1 табл.. ного агента и сыворотки крови в течение 1,5 года (111 пассажей). Штамм .назван Lebr 1/1-Sf и депонирован под номером ВСКК (П) Р 107 Д.

Стандартные условия выращивания.

Штамм культивируют на смеси, состоящей из равных объемов ростовой среды

Игла, модифицированной Дальбекко (ДИЕМ), и среды 199 беэ добавления сывортки крови. Культивирование проо водят в инкубаторе при 37 С в герметических флаконах.

Культуральные свойства. Способ культивирования монослойный. При пересеве каждые 96 ч кратность рассева составляет 1:3. Через 2 сут после пересева производят смену культуральной среды. Для пересева культуру пе1495374 реводят в суспензию в кондиционированной среде с помощью резинового скребка и распределяют так, чтобы кондиционированная среда составляла

30 от объема свежей среды. При ука- занных условиях культивирования посевная доза составляет 1,0 10 кле5 ток на 1 см, максимальная плотность популяции равняется 3,0 1 10 клеток

5 на 1 см, время удвоения популяции

48 ч.

При соблюдении описанных условий культивирования, клетки штамма хорошо распластываются на подлржке, имеют 15 полигональную форму и образуют многослойные культуры, Кариологическая характеристика штамма.

Анализ 100 метафазных пластинок 20 хромосом, окрашенных по Гимза, показал, что число хромосом в клетках; штамма варьирует от 44 до 112, а модальный класс популяции (58 ) составляют клетки с 56 хромосомами (40 од- 25 но- и 16 двуплечих хромосом). Распределение клеток по числу хромосом представлено в таблице в процентах.

Маркерные признаки. К числу мар-..;

I керных признаков штамма относятся,:: 30 устойчивость к цитологическому действию бромистого этидия концентрации

1-.5 мкг/мл и способность размножаться в среде без сыворотки крови. Оба признака стабильно воспроизводятся в ряду клеточных поколений и имеют генетическую природу. Наиболее существенным признаком клеток Lebr 1/1-Sf является способность к длительному размножению в среде без сыворотки.,щ

Название полезного вещества, продуцируемого штаммом, и его характе- . ристика. Клетки Lebr 1/1-Sf синтезируют ростстимулирующие факторы. Наличие таких факторов в среде, кондиционированной клетками штамма, установлено с помощью двух общепринятых тестов. Присутствие ростстимулирующих факторов обнаружено при клонировании ьянимально трансформированных клеток линии NRK в среде с агаром на облученной рентгеном (доза облучения 500 рад) культуре Lebr

1/1-Sf в отсутствии факторов сыворотки крови. В этих условиях эффективность клонирования клеток линии

NRK составляет 5 «10" . Наличие ростстимулирующих факторов установлено также по увеличению интенсивности включения Н-тимидина в стационарные культуры минимально трансформированных клеток линии ЗТЗ. С этой целью используют Среду, кондиционированную клетками штамма Lebr 1/1 † в течение 2 сут с момента пересева. Неразведенная кондиционированная среда, так же как и разбавленная в 2 или 4 раза, вызывает более чем 2-кратное увеличение включения Н-тимидина в стационарных культурах клеток ЗТЗ.

Среды, кондиционированные клетками Lebr 1/1-Sf, сохраняют полную ростстимулирующую активность по крайней мере в течение 3 мес хранения

О при — 20 С. Признак продукции фактора стабильно воспроизводится в течение более чем 100 генераций, Ростстимулирующие факторы обнаруживают в культуральной среде. Концентрация общего белка через 2-3 сут в кондиционированной среде составляет 2-, 5 мкг/мл.

Ростстимулирующую активность определяют в тестах: стимуляция включения Н-тимидина в стационарной культуре минимально трансформированных клеток NIH 3T3; индукция клонирования минимально трансформированных клеток

NRK в среде с агаром; стимуляция размножения массовых культур гибридомнык клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки крови и увеличение эффективности клонирования гибридомных клеток.

Способ криоконсервирования. Клет= ки замораживают в смеси сред ДМЕМ и

199 (1: 1 по объему) с добавлением

10 сыворотки крупного рогатого скота и 10 . DMSO. Режим замораживания: 1 С в 1 мин до -20 С, 5 С в

1 мин до -50 С и 10 С в 1 мин до

-196 С. Клетки хранят в жидком азоте. Режим отогрева: водяная баня

+40 С в течение 1 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервации

75-80 .

Другие особенности штамма. После

6 подкожной инъекции 2-5 ° 10 клеток на мышь опухоли форьмруются у 20 мышей линии СЗН.

Контаминации не обнаружено.

Пример 1. Штамм Lebr 1/1-Sf используют для получения кондиционированной среды, содержащей факт оры, которые стимулируют размножение гибридом — продуцентов моноклональных антител. Кондиционированную среду

1495374 (к-среда) получают при культивировании клеток Lebr 1/1-Sf на среде

ДИЕИ и 199 (1: 1 по объему) при 37 С через 2 сут после пересева. Среду отделяют от клеток центрифугированием (5000 об/мин в течение 20 мин), храо нят при — 20 С и используют для культивирования гибридом — продуцентов моноклональных антител против анти- 1р генов эритроцитов крупного рогатого скота и свиней (штаммы 8Д9 и Д55).

Для этого сначала получают перитонеатальный эксудат мышей с помощью промывания брюшной полости мыши лис нии ВЛ1.В/с 5-ю мл ростовой среды следующего состава: среда ДМЕМ, содержащая 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 ыИ неосновных аминокислот и 5 х 10 M 2-меркаптоэтанола 20 (Гс). После разбавления до ?4 мг Гс суспензию макрофагов (ИФ) распределяют по лункам двух 24-луночных панелей по 1,0-2,0 10 ИФ в 0,5 мл среды на лунку и помещают в инкубатор 25 (37 С, 5-7% СО, 100 влажности) .

Через 1 сут после посева ИФ клетки гибридомы осаждают центрифугирозанием (10 мин при 1000 об/мин), промывают Гс, делят на две части и повтор- 30 но осаждают ° Одну часть ресуспензируют в смеси, состоящей из равных объемов Гс и к-среды, содержащей 2 эмбриональной сыворотки крови, подсчитывают число клеток и после разбавления суспензии до концентрации 5 > 10

В клеток в 1 мл распределяют по лункам

24-луночной панели, не содержащей МФ (1 мл суспензии на лунку), Другую часть ресуспенэируют в к-среде и пос- 40 ле подсчета числа клеток и разбавления до концентрации 1,0 " 10 клеток на 1 мл распределяют по лункам 24-луночной панели, содержащей МФ (0,5 мп суспензии на лунку). Аналогично приготавливают и распределяют по лункам

24-луночно панели суспензию гибридомных клеток в Гс без добавления к-среды с содержанием сыворотки 2 и 10, а также на панель с МФ в Гс без сы- 50 воротки (контрольные условия). Все

1 панели помещают в инкубатор. Затем каждьп - . день в течение 8 сут культивирования подсчитывают число Kup7.QK гибридомы в лунках и устанавливают титр антител в культуральной жидкости. Титр антител определяют с помощью реакции агглютинации эритроцитов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление к-среды в среду с пониженным содержанием сыворотки крови или ее полном отсутствии стимулирует размножение гибридомньх клеток: так величина максимальной плотности в среде с 2 сы5 воротки составляет 4,5 10 клеток на 1 мл, а в среде без сыворотки с питающим слоем ИФ вЂ” 3,7 10, что

5 незначительно отливается от таковой на среде с 10 . сыворотки крови (5,2" х 10 ). По мере достижения максимальS ной плотности гибридомные клетки пересевают в среде, содержащей 25 или

50 к-среды и по крайней мере.в течение 3 пассажей они сохраняют способность эффектно размножаться в этих условиях. Титр антител в культуральной жидкости возрастает пропорционально количеству клеток гибридомы в лунке и не зависит от содержания сыворотки крови в среде, при достижении максимальной плотности популяции в среде без сыворотки титр моноклональных антител не отличается от такового в среде с 10, сыворотки крови.

Таким образом, использование к-среды штамма Lebr 1/1 † в качестве источника ростстимулирующих факторов, позволяет не применять дорогостоящую эмбриональную сыворотку крови или значительно снизить ее расход при культивировании гибридом — продуцентов моноканальных антител.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (II) К - 107

Д вЂ” продуцент ростстимулирующих факторов гибридом.

1495374

44 52 54 55 56 57 58 84 112

Количество хромосом

Количество клеток с данным числом хромосом

2 2 2- 4 58 12 12 6 2

Составитель А.Маныкин

Техред M,Дидык

Корректор 0.Ципле

Редактор Н.Гунько

Заказ 4216/25 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,!01