Способ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции лесных пород для ускоренного получения константных форм, в исследованиях по экспериментальной эмбриологии и лесной генетике. Целью изобретения является увеличение каллусообразования. Способ состоит в том, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, содержащиеся в пыльце микростробилов, собранных в фазе начала цветения. Получен гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений, у кедра атласского, кедра ливанского, кедра гималайского на питательных средах Мурасиге-Скуга, Нича, Уайта. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5Н 4 С .12 И 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Г

К Д ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4252500/28-13 (22) 17.03.87 (46) 30 ° 07.89. Бюл. 1Ф 28 (71) Государственный Никитский ботанический сад (72) И.A. Ругузов, Л.Я. Склонная, А.В. Кожемякин и С.И. Кузнецов (53) 578.085 ° 23(088.8) ( (56) Experimental embryology of vascular plants. Edited Ъу В.М. Johry

Springer. — verlag Berlin Heidelberg-New York, 1982, р. 37-41. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНОГО

КАЛЛУСА ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ КЕДРА (57) Изобретение относится к биотех-Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции лесных пород для ускоренного получения константных hopM, в исследованиях по экспериментальной эмбриологии и лесной генетике.

Цель изобретения — увеличение каллусообразования.

Способ состоит в том, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, которые содержатся пыльце микростробилов, собранйых в

:фазе начала цветения, Способ осуществляется следующим образом.

С деревьев кедра (атласского, ливанского и гималайского) в фазу начала цветения собирают пыльцу и готовят постоянные препараты — мазки развития микрогаметофита, окрашенные

„„SU„, 1497212 А1 нологии и может быть использовано в селекции лесных пород для ускоренного получения константных форм, в исследованиях по экспериментальной эмбриологии и лесной генетике. Целью изобретения является увеличение каллусообразования. Способ состоит в . том, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, содержащиеся в пыльце микростробилов, собранных в фазе начала цветения.

Получен гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений, у кедра атласского, кедраливанского, кедра гималайского на питательных средах Мурасиге-Скуга, Нича, Уайта. 1 табл. метиловым зеленым пиронином, Препараты анализируют под микроскопом и отбирают деревья, в пыльце которых содержится 2-4Х аномальных пыльцевых зерен.

Пыльцу из микростробилов собирают в фазу начала цветения, поскольку микростробилы, собранные в более ранние сроки, не раскрываются при помещении их в пробирку, а собранные позже не содержат необходимых для индукции каллуса аномальных пыльцевых зерен.

Как показал цитоэмбриологический анализ, в микростробилах кедра, используемых в предлагаемом способе, содержится следующая смесь пыльцевых зерен: 1) оптически пустые пыльцевые зерна, 2) микроспоры, 3) фертильные пыльцевые зерна, 4) пыльцевые зерна с ускоренным развитием мужского raMe3 149721 тофита, 5) пыльцевые зерна с замедленным развитием мужского гаметофита, 6) жизнеспособные пыльцевые зерна негаметофитного пути развития, 7) жизнеспособные пыльцевые зерна, 8)

5. пыльцевые зерна с тремя-четырьмя воздушными мешками и гигантские пыльцевые зерна.

В результате исследований установ- 10 лено, что именно клеточные структуры

5-8, которые можно объединить под общим названием аномальные пыльцевые зерна, дают начало формированию гаплоидного каллуса in vitro. Максималь- 15 но возможное число таких структур в пыльце кедров без дополнительной индукции составляет 4 .. Если в пыльце содержится менее 2 этих клеточных структур (аномальных пыпьцевых. зерен),20 то формирование каллуса подавляется пыльцевыми зернами, которые образуют пыльцевые трубки, формируют базальностебельковый комплекс и гаметы.

Закрытые микростробилы стерилизуют и после помещения аномальных пыльцевых зерен на питательную среду получают гаплоидный каллус.

Пример 1. Приготовление препаратов-мазков включает фиксацию и 30 обезвоживание объекта, насьш(ение его растворителями бальзама, приклеивание белком, окрашивание и заключение в бальзам. Для фиксации используют фиксатор Карнуа, состоящий из 6 ч абсолютного (100Х) или 96 .-ного эта35 нала, 3 ч. хлороформа и 1 ч ледяной уксусной кислоты, Затем готовят белок для наклеивания объекта. Зрелую пыльцу или содержимое пыльника фикси 40 руют непосредственно на предметном стекле, делают мазок диаметром не более 2 см, подсушивают, промывают

70 -ным этанолом и снова подсушивают, затем приклеивают белком и окрашивают пиронином метиловым зеленым. Время окрашивания у кедра составляет 18 ч.

После окрашивания проводят дифференциацию в 96Х-ном этаноле в течение

12 мин. Затем препараты обезвоживают в бутаноле первом и втором (в общей 50 сложности 1 ч), просветляют в ксилоле первом и втором (не менее 2 ч) и заключают в бальзам.

Анализ препаратов проводят при малом увеличении. Просмотр и излуче- 55 ние препаратов осуществляется по диагоналям, проведенным мысленно чег реэ покровное стекло, не менее чем в десяти полях зрения с тем, чтобы было учтено не менее тысячи пыльцевых зерен каждого варианта. Учитывают все типы аномального морфогенеза мужского гаметофита.

С отобранных таким образом деревьев кедра атласского, содержащих

2-4Х аномальных пыльцевых зерен, собирают в фазу начала цветения цельные закрытые микростробилы, которые дезинфицируют обжиганием, оборачивают стерильной фильтровальной бумагой так, чтобы микростробилы, не проваливаясь, с трудом входили в пробирку.

Подготовленные таким образом микростробилы вводят в пробирки, на 1/3 наполненные питательной средой Мурасиге-Скуга, Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками °

Через 27-34 сут, в зависимости от оводненности диплоидных тканей микростробила, в каждой из пробирок формируется гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений.

Пример 2. Все приемы аналогичны приемам примера 1, только исследуется кедр ливанский и использу-, ется питательная среда Нича.

Пример 3. Осуществляется аналогично примерам 1 и 2, только исследуется кедр гималайский и используется питательная среда Уайта.

Кроме данных примеров, аналогично аномальные пыпьцевые зерна всех трех исследуемых видов кедра высаживали на все указанные выше питательные среды.

Результаты опытов сведены в таблицу.

Формула изобретения

Способ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра, включающий культивирование на искусственной питательной среде выделенных микроспор и микрогаметофитов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения каллусообраэования, для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, находящиеся в пыльце микростробилов, собранных.в фазе начали цветения, при содержании их в микростробилах 2-4 °

1497212

Выход каллуса мг сырого веса на 10 пробирок по. вариантам опыта при культивировании на различных питательных средах

Вид кедра среда Иура- среда Нича среда Уайта сиге-Скуга

Составитель В.Демкин

Техред М.Ходанич

Корректор О.Ципле

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 4406/29 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государс твенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производствен м-издательский комбинат "Патент", г.)жгород, ул. Гагарина, 101

Атласский

Ливанский

Гималайский