Способ культивирования ткани кукурузы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности, к культивированию тканей растений IN VITRO. Целью изобретения является повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности. Способ состоит в том, что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга производится дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-диазоцетилбутан в количестве 1-10 мг/л. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4353389/31 — 13 (22) 04. 01. 88 (46) 15. 09.89. Бюл. Р 34 (71) Институт физиологии растений АН УССР (72) Т.Н.Чеченева, В.А.Труханов и В.В.Моргун (53) 578.085.23 (088.8) (56) Green С., Philfips R. Plant

regeneration from tissue cultures

of maise. — Grop Science 1975, t5,Ð 5, р.417 †4.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивйрованию тканей растений in vitro, а имеено к способам индукции каллусообраэования у злаков, являющейся этапом при регенерации растений путем побегового морфогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре ткани злаков и позволяющей получать измененные генотипы вследствие спонтанной сомаклональной и индуцированной мутационной изменчивости клеток.

Цель изобретения — повышение индукции каллусообразования и регенерацяонной способности.

Способ состоит в том, что перед перенесением зародышей на модифици„„SU„„1507792 А 1

2 (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТКАНИ

КУКУРУЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей растений in vitro.

Целью изобретения . является повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности. Способ состоит в том; что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга производится дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразова ия вводят 1,4, диазоцетилбутан в количестве 110 мг/л. 2 табл. рованную твердую питательную среду

Мурасиге-Скуга (МС) производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-бисдиазоацетилбутан (ДАБ) в количестве 1 — 10 мг/л (ДАБ известен как мутаген). Проведенные исследования показали возможность использования его как стимулятор каллусообразования.

Способ осуществляется следующим образом.

После стерилизации и промывки початков вычлененные незрелые зародыши инкубируют в течение 1 ч в жидкой питательной среде МС с ДАБ. Затем тщапромежуточной реакции между собствен" но каллусообразованием и прорастанием: одновременного формирования каллуса и недоразвитого побега. Недоразвитый побег отделяют, а оставший ся каллус можно культивировать дальше.

Пример 4. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

2, однако количество ДАБ составляет

100 мг/л. Ведущей реакцией является промежуточная реакция, собственно каллусообразование составляет 2,85%, что на порядок меньше, чем в примерах.2 и 3.

Пример 5. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

1, но возраст незрелых эародьпйей скороспелой линии ВС 2923 составляет

17 дней после опыления. Каллусообраэование отсутствует, наблюдается лишь прорастание зародышей.

Пример 6. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

2, возраст зародышей 17 дней (табл.2).

Содержание ДАБ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается появление каллусообразования, промежуточной реакции, корнеобразования.

21,72 + 3,12 = 24,84%.

Пример 7. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 6, однако количество ДАБ сос" тавляет 10 мг/л. Общая величина каллусообразования 13,62 + 6,25 =.21,87%.

H p и м е р 8. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере б, однако количество ДАБ составляет

100 мг/л. Общая величина каллусообразования 3,12 + 15,62 = 18,84%. Ведущей реакцией зародьплей является промежуточная, собственно каллусообразо-. вание составило 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах 6 и 7.

Пример 9. Условия проведения опыта соответствуют описанным в примере 1, но возраст незрелых зародышей скороспелой линии ВС 2923 составляет

18 дней после опыления. Каллусообразование отсутствует, наблюдается лишь прорастание эародышейй.

Пример 10. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере .

2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ в жидкой питательной среде

1 мг/л. При этом наблюдается появление

3 150779 ельно трижды отмывают жидкой пита ельной средой. Для хранения вычлененных зародышей,, обработки зародышей

) АБ и отмывки от него используют жид5 кую питательную среду, но без 2,4ихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д), минокислот и агара. Обработка расторами ДАБ проводится в чашках Петри ри комнатной температуре. Культиируют по два зародыша в пробирках

i0 мл среды при 27 + 1 С и 16-чаовом фотопериоде. В качестве стимуятора- каллусообраэования используют

Б в количестве 1-100 мг/л среды, аточный раствор ДАБ стерилизуют ропусканием через бактерицидный фиьтр. Твердая питательная среда для ндукции каллуса содержит 0,25 мг/л ,4 Д. 20

Пример 1, Незрелые початки инии ВС2923, взятые на критический

16-й день после цветения, поверхостно стерилизуют лабораторным детерентом, трижды промывают стерильной 25 одой. Вычленяют из зерновок незрелые

1 зародыши, удаляют эндосперм. Далее незрелые зародыши переносят на твер(цу ю культуральную среду и размещают тком вверх. Каллус инициируют и сохраняют на модифицированной среде

С, содержащей неоРганические компо- . Общая величина каллусообраэования ненты по Мурасиге и Скугу, витамины и аминокислоты по Штраусу, 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара. Индукция каллу-35

1 сообразования достигается при-исполь зовании в качестве стимулятора роста ( гербицида 2,4 Д в концентрации

0,25 мг/л. Через 28 дней культивирования проводят учет,. Данные представ-щ лены в табл.1. Каллусообразование отсутствует, наблюдается лишь прорастание зародышей..

Пример 2. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 1, однако перед посадкой зародышей для культивирования на твердую питательную среду, помещают их на 1 ч в жидкую питательную среду, содержащую

1 мг/л ДАБ. Затем трижды отмывают жидкой питательной средой без ДАБ.

При этом наблюдается каллусообразование 24,13%., корнеобразование и прорастание зародышей.

П р и м е Р 3. Условия проведения5 опыта аналогичны описанным в примере

2, однако количество ДАБ составляет

10 мг/л. При этом наблюдается увеличение общего каллусообразования

1507792 формулаизобретения

25 каллусообраэования промежуточной реакции, корнеобразования. Общая вели-, чина каллусообразования 18, 75 + 6,25

25%.

Пример 11. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ 10 мг/л. Общая величина каллусообразования 15,б2 + 12,50 = 28,12%

П р. и м е р 12. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ 100 мг/л. Общая величина каллусообразования 3,12 + 9,37 =

12,49 %. Ведущей реакцией зародышей является промежуточная, собственно каллусообразование 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах

10 и 11. 20

Таким образом обработка незрелых зародышей скороспелой линии ВС 2923

ДАБ в количестве 1; 10 и 100 мг/л расширяет спектр ростовых реакций незрелых зародышей критического для данной линии 16-дневного и старшего возраста и обеспечивает возможность получения каллуса еще в течение 2-3 дней. Кроме наблюдаемых в контроле прорастания и прекращения развития зародышей в вариантах с обработкой

ДАБ отмечены каллусообразование, промежуточная реакция (формирование одновременно каллуса и недоразвитого побега), интенсивное корнеобразование.

Каллус индуцируется двух типов: рых35 лый, светло-желтый с участками позеленения, из которого в дальнейшем возможна регенерация растений, т.е. тотипотентный и плотный компактный белый. Образование тотипотентного морфогенного каллуса чаще наблюдается . при содержании ДАБ 1 — 10 мг/л.

При содержании ДАБ 100 мг/л преобладает образование неморфогенного 45 белого плотного каллуса, полученного в основном от зародьппей, для которых характерна промежуточная реакция между собственно каллусообразованием и прорастанием.

Таким образом, предлагаемый способ индукции каллусообразования из незрелых зародышей кукурузы, включающий обработку зародышей перед культивированием мутагеном ДАБ в количестве

1-10 мг/л более эффективен по сравнению с известным, так как позволяет увеличить в два раза временной промежуток для введения в культуру незрелых зародьппей кукурузы, обеспечивает при этом изменение спектра ростовых реакций зародышей определенного возраста и получение тотипотентного каллуса, что воэволяет повысит эффективность селекционной работы на клеточном уровне °

Способ культивирования ткани кукурузы, включающий вычленение зародышей из простерилизованного початка, перенесение их на модифицированную твердую питательную среду МурасигеСкуга, содержащую в качестве стимулятора каллусообразования 2,4дихлорфеноксиуксусную кислоту„ и

1 дальнейшее их культивирование, о т— л и ч а ю шийся тем, что, = --целью повьппения индукции каллусообразования и регенерационной способности, перед нанесением зародышей на твердую питательную среду производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой модифицированной питательной среде Иурасиге — Скуга, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4 — диазоцетилбутан в количестве 1 — 10 мг/л.

1507792

Таблица 1

2,4Д, мг/л

Ростовые реакции незрелык зародышей кукурузы после обработки ДАБ

Ростовая реакция зародышей, Х

Каллус Каллус + Прорастание недоразвитый побег

ДАВ мг/л

Возраст зародышей, день

Пример,к т Корне- Развиобразо- тня ванне нет

0,25

53,12

41,37

34,48

46,87

24, 13

24, 13

20, 68

2,85

10, 34

0,25

13, 79 .

25,71

0,25

31,03

2,85 .25,71

100

0,25

42,85

0 0,25

40,52

31,25

59,38

31,25

25,00.6

0,25

21, 72

15,62

3,12

12,50

0,25

6,25

6%25 46,87

100

0,25

3,12

15,62

25,00

62,50

34>37

56,25

37,50

0,25

6,25

0,25

18, 75

15,02

3,12 37 51

0,25 18

12,50

6,25

12,50

37,51

40,36

28;12

34,66

12

100

0,25

3,12

9,37

Таблица 2

Влияние возраста незрелых зародьппей линии ВС2923 на индукцию каллусообразования

Данные об изолированных эародьппах

Каллусообраэование, Х

Длина, мм

Количество 2 4 Д (мг/л) ! . ?

Возраст, дни

2,0

0,25

40,6

9,36

50,00

46,15

9,09

16

10,71

Составитель В.Демкин

Редактор Л.Пчолинская Р.ЬВй%

Заказ 5516/29 Тираж 501 Подписное

BHHHlIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

1,0 — 1,2 i,0 — 1,5

1,5 — 2,0

2,0 — 2,5

2,5 — 3,0

15,62

31i81

32,14

38, 12

18,18 ! 1,53