Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к липопротеидам низкой плотности плазмы крови человека

 

Изобретение относится к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека. Цель изобретения - создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мышиные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к антигену. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 179Д. Продуцирует монАТ, относящиеся к JGG<SB POS="POST">1</SB>. Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей. Секреция монАТ на 3-4 день культивирования ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, связывает 8,43 мг ЛНП. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4363021/28-13 (22) 12,01.88 (46) 07.10.89 Бюл. Р 37 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) И.Ю.Адамова, Т.H.Âëàñèê, Е,А,Ковалева, С,Н,Покровский, И,Н.Трахт и Е.В.Янушевская (53):578.085.23(088,8) (56) Cole Т.G,> Schonfeld (. J, Lipid

Ressarch..1983, 24, р.1494-1499.

Patton J.G. Alley М.С. Mao S.Х.

Uranology Methods. 1982, 55, р.193203, Koren E. et a1. ВВА, 1986, 876, р. 101-107. (54) штАмм ГиБРиДных культиВиРуемых

КЛЕТОК EHBOTHbIX MUS MUSCULUS, ИСПОЛЬзуемый для пОлучения мОноклойлльных

АНТИТЕЛ К ЛИПОПРОТЕИДАМ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления антигена— липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека при заболеваниях, связанных с нарушением липидного обмена, для выявления и определения ЛНП в плазме крови и биологических жидкостях, Целью изобретения является создание штамма гибридных клеток продуцирующих моноклональные мьппинные антитела к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к антигену. (д1) 4 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395

2 (57) Изобретение относится к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП)

;из плазмы крови человека. Цель изобретения — создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мьппиные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к анти, гену.Итамм; депонирован под номером

ВСКК (П) Ф 1790. Продуцирует монАТ, относящиеся к ggG,. Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей.Секреция монАТ на 3-4 день культивирования ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, связывает 8,43 мг ЛНП.

2 табл.

Итамм получают следующим образом.

Мышей линии 3ALB/С иммунизируют внутрибрюшинно введением 100;мкг белка ЛНП, выделенные из плазмы крови человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР), содержащего ЗОБ полного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 дней 5 10 клеток селезенки иммунных мьппей гибридизуют с 5 ° 10 клеток миеломы мы5 ши Х63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 457 (об./об./). полизтиленгликоля (ПЭГ) мол.м. 3350 и 157. диметилсульфоксида, в течение

1 мин. После гйбридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в

Результаты примера демонстрируют в

60 раз более высокую по сравнению с известным штаммом ЛНП-связывающую активность моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма 5F8.

Пример 2. Препарат монАТ, иммобилизованный на 3 мл сефарозы, как описано в примере 1, помещают в колонку и пропускают 20 мл человеческой донорской плазмы в течение 1 ч. Определяют общий холестерин плазмы до и после колонки, используя набор реактивов для определения холестерина.

В табл. 2 представлены сравнительные данные по эффективности уда- . ления ЛНП из плазмы крови человека.

Данные опыта свидетельствуют о высоКОЙ эффективности удаления холестерина ЛНП из плазмы крови человека мо50

3 151303

96-луночные панели по 2 10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду

RPMI-1640 с добавлением 10 . лошадиной 5 и 10Ж телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 10 М ами- ноптерина и 1,6 ° 10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют дна раза методом конечных разведений, высевая 10 по 1 клетке в лунку, содержащую 4х10" клеток селезенки. После второго клонирования практически 100 субклонов продуцируют антитела к ЛНП плазмы крови человека. Полученный штамм обо- 15 значен как А-LDL-5F8, депонирован в Банке клеточных культур Института цитологии под номером ВСКК (II)

Ф 179D и характеризуется следующими признаками, 20 .Стандартные условия культивирования — среда RPMI-1640 с добавлением

10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10 лошадиной сыворотки, 4 мкМ

L-глютамина, 10 мкМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина,аминокислоты для базальной среды Игла, витамины для среды Игла и 0,05 меркаптоэтанола, при

37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты, Для выращивания используют пластиковую посуду.

Посевная доза 10 клеток в 1 мл.

Клетки пассируют один раз в 3-4 дня.

Кратность рассева 1:10, Культура по- 35 луприкрепленная. Культивирование в организме животных. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мьппей

BALB/Ñ, обработанных пристаном, в ко-40 личестве (2-5) 10 клеток на мьппь.

Опухоли развиваются у мышей в течение 12-16 дней. Штамм перевиваем.

Продуктивность штамма. Секреция монАТ на 3-4-й день культивирова- 45 ния составляет 30-50 мкг/мл культуральной среды и 5-10 мг/мл асцитической жидкости, Характеристика полученного продукта.

Штамм продуцирует манАт., относящиеся к "(8Г классу (Я8С,), Метод оценки специфичности: тест на связывание антителами иммобилизованных лиПОпротеидОВ низкой плОтности имму- 55 ноферментный метод.

Стабильность продукции. Продукция антител сохраняется как минимум в течение 8 пассажей в культуре и при культивировании в виде асцитной опухоли.

Криоконсервирование. Для длительного хранения гибридные клетки могут быть заморожены в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10 . диметилсульфоксида. Режим замораживания:

4 С/мин до 4 С,затем 1 С/MHH до -40 С, затем клетки переносят в жидкий азот.

Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37 С ..

Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена.

Н р и м е р 1. Моноклональные антитела выделяют из асцитной жидкости ионообменной хроматографией íà DE-целлюлозе. Полученные антитела иммобилизуют на сефарозу, активированную BrCN, в количестве 10 мг AT на 1 мл геля сефарозы. 100 мкл полученного таким образом препарата иммобилизованных на носителе антител помещают в пробирку и добавляют ЛНП, выделенные из плазмы крови нормальных доноров. Смесь инкубируют в течение ночи при 4 С, затем центрифугируют в течение 1 мин при 2000 g. Раствор, содержащий несвязавшиеся ЛНП, отбирают, сефарозу с иммобилизованными AT промывают 2 ра за 1 мл фосфатного буфера. Затем добавляют 1 мл глицинового буфера содержащего 0,2 М глицина, О, 15 M NaC1, рН 2,5. По методу Лоури определяют количество белка ЛНП в растворе.

Результаты опыта по определению количества ЛНП, связываемых монАТ, иммобилизованными на сефарозе С1.-4В,приведены в табл.1.

Таблица 1

3 C

Количество белка ЛНП, связываемое

10 мг монАТ, иммобилизованных на агарЬзном носителе, м1 монАТ

8,43 (матрица — "Affi-Gel 10)

0,14 (матрица "Sepharose CL-4B)

Штамм 508

Известный штамм

Таблица 2

Количество холестерина в плазме, мг

Штамм до колонки после колонки

32,5

56,2

Штамм 5F8

Альбумин, бычий сывороточный

56,1

56,2

Составитель Г.Смирнова

Техред Л.Олийнык Корректор М.Васильева

Редактор В.Петраш

Заказ 6043/27 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1513030 6 ноклональными антителами, вырабаты- ладаюшие в иммобилизованном состоянии ваемыми клетками штамма 5F8. в 60 раз более высокой связывающей

Таким образом, штамм 5FB имеет активностью по отношению к антигену. большое практическое значение и моно5 клональные антитела, вырабатываемые Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я этим штаммом, могут быть успешно использованы в практической медицине Штамм гибридных культивируемых кледля эффективного удаления ЛНП из ток животных Mus musculus ВСКК (II) плазмы крови пациента. Ф 1790, используемый для получения моноклональных антител к липопротеи-.

По сравнению с известным предлага- дам низкой плотности плазмы крови чеемый штамм вырабатывает антитела, об- ловека.