Способ количественного определения микроорганизмов в тканях

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике гнойных и раневых инфекций. Цель изобретения - ускорение способа. Для определения концентрации микроорганизмов исследуемый образец ткани гомогенизируют в физиологическом растворе, инкубируют в воздушном термостате. Затем гомогенат последовательно обрабатывают смесью растворов тритона Х-100 в концентрации 0,05-0,08% и периодата натрия в концентрации 1-5 мМ на объем гомогената и диметилсульфоксидом при объемном соотношении 1:(4-9). Далее в гомогенате биолюминесцентным методом определяют концентрацию АТФ, на основании которой выносят суждение о количестве микроорганизмов в анализируемом образце ткани. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4357585/28-13 (22) 08.12.87 (46) 15,09.89. Бюл. N - 34 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова и

Научно-исследовательский институт лазерной хирургии (72) Н.Н.Угарова, Л.1о.Бровко, А.И.Титов, П.И.Толстых, И.С.Вартанян, В.И.Рябов и В.К.Гостищев (53) 576.8.093.1 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

К9 1041568, кл. С 12 Q 1/04, 1982. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ТКАНЯХ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике гнойных и ранеИзобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике гнойных и раневых инфекций, Цель изобретения — ускорение способа, Пример 1. Образец ткани весом 1 г переносят в стерильную ступку, размельчают стерильными ножницами, добавляют 9 мл стерильного физиологического раствора 0,5 г толченого стекла, тщательно растирают пестиком и переносят гомогенат ткани в стерильную пробирку. Гомогенаг ткани, содержащий 10 микробных клеток в 1 мл помЕщают в воздушный термостат с температурой 37 С и выдерживают 5 ч.

Отбирают пробу объемом 1 мл и добав„„SU„„150?795 А 1 (дц 4 С 12 Q 1/04, С 12 N 5/00

2 вых инфекций. Цель изобретения — ускорение способа. Дпя определения концентрации микроорганизмов исследуемый образец ткани гомогенизируют в физиологическом растворе, инкубируют в воздушном термостате. Затем гомогенат последовательно обрабатывают смесью растворов тритона Х-100 в концентрации 0,05-0,08Х и периодата натрия в концентрации 1-5 мМ на объем гомогената и диметилсульфоксидом йри объемном соотношении 1:4-9. Далее в гомогенате биолюминесцентнйм методом определяют концентрацию АТФ, на основании которой выносят суждение о количестве микроорганизмов в анали- д

Ф зируемом образце ткани. 1 табл, Фе4 . ляют 0,01 мл 100 мМ раствора периодата ф натрия в 57-ном тритоне Х-100 для <юр получения окончательных концентраций

1 мМ и 0,05K соответственно, выдерживают при комнатной температуре 3 мин, Затем из полученной смеси отбирают пробу объемом 0,2 мл и добавляют к СЛ

0,8 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Полученный препарат используют для определения концентрации АТФ. Для этого в прозрачную пробирку объемом 1,5 мл помещают 0,9 мл биолюминесцентного реагента на основе иммобилизованной и люциферазы светляков. Регистрируют фоновое свечение. реагента (1,„), затем вводят 0,1 мл образца, полученного,; как описано выше. и регистрируют свечение образца (1 с ). Затем в ту же

Продолжение таблицы г

З 10 -З 10

)3.10

630-1000

>1000

Формула из обретения

30 3 -10

3 10 -3 "10

З 104-З .10 (60

60-100

100-160

160-250

250-400

400-630

3 1О -3 1О

З -10 -3 10

З 10 -З-1О8

Составитель Г.Смирнова

Техред М.Моргентал Корректор Н.Борисова

Редактор M.Ïåòðoâà

Заказ 5516/29

Подписное

Тираж 501

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент „ г.ужгород, ул. Гагарина, 101

3 1507795 пробирку вводят 0,01 мл 10-микромолярного раствора АТФ и регистрируют приращение интенсивности свечения (Ic ). Концентрацию АТФ в образце рассчитывают по формуле:

5000 (Igsg I он )

ГАТФ1 нМ вЂ”, Т ст

Пример 2. Готовят суспенэии ,микроорганизмов, наиболее часто встречающихся в медицинской практике (Pseudomonas aeriginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphilococcus

aureus $. epidermis, Klebsiella, En- 15

;tегоbacter, Acinetobacter, P.maltophilia) в физиологическом растворе с

9 различной концентрацией (от 10 до

10 клеток в 1 мл). Приготовление стерильного образца ткани ведут сог- 20 ласно примеру 1, используя вместо физиологического раствора суспензию микроорганизмов. Инкубацию (5 ч) и последующую обработку и измерение АТФ ведут по примеру 1, В таблице приве- 25 дена зависимость концентрации АТФ от содержания микроорганизмов в образце. .!

Данные, приведенные в таблице, соответствуют прямолинейной зависимости с коэффициентом корреляции

0,93.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет в 5-10 раз сократить время анализа, упростить процесс, исключив три наиболее трудоемких операции на стадии культивирования, увеличить точность за счет создания специфической среды роста. Способ обладает высокой надежностью и экономичностью.

Способ количественного определения микроорганизмов в тканях путем гомогениэации исследуемого образца в физиологическом растворе с последующим инкубированием и учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, после инкубирования гомогенат последовательно обрабатывают смесью растворов тритона Х-100 в концентрации

0,05-0,08% и периодата натрия в концентрации 1-5 мМ на объем гомогената и диметилсульфоксидом при объемном соотношении 1:4-9, затем в гомогенате определяют к личество АТФ биолюминес-! центным мета ом и по ее величине определяют. концентрацию микроорганизмов в образце.