Способ определения активности моноаминооксидазы

 

Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии. Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа. Способ осуществляют следующим образом. К водной среде измерения, содержащей субстрат моноаминооксидазы (МАО), дециламин, а также бактериальную люциферазу и ее субстраты, добавляют анализируемый препарат МАО и на люминометре измеряют биолюминесценцию, по уровню нарастания которой судят об активности МАО. Способ позволяет измерять ферментативную активность до 40 пмоль субстрата в 1 мин в пробе.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕС11УБЛИ К

„„SU„„1523 761 А 1 (51)4 С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A ВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (57) Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии. Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа.

К водной среде измерения, содержащей субстрат моноаминооксидазы (МАО)„ дециламин, а также бактериальную люциферазу и ее субстраты, добавляют анализируемый препарат МАО и на люминометре измеряют биолюминесценцию, по уровню нарастания которой судят об активности моноаминооксидазы. Способ позволяет измерять ферментативную ак— тивность до 40 пмоль субстрата в 1 мин в пробе. (2 i ) 4275!)24/31-13 (22) 03.07.87 (46) 15.11.89. Бюл. И - 42 (71) МГУ им.M.В.Ломоносова (72) А.И.Соболев, В.Ç.Горкин, В.С.Данилов, М М.Мажуль, И.А.Малков, Т.А.Москвитина и Л.Н. Овчинникова (53) 663.18 (088.8) (56) Волковицкая О.Э., Бочев П.Г., Рибаров С.P.. Горкин В.3., Коган В.Е.

Исследование моноаминоксидазной активности митохондрий плаценты человека методом хемилюминесценции. — Вопросы медицинской химии, 1986, т . 32, У- 5, с. 77-79, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

МОНОАМИНООКСИДАЗЫ. дециламнн 5-50 мкМ, после чего в кювету добавляют бактериальную люцифе- Щ разу до конечной концентрации 10100 мкг/мл. и препарат моноаминооксидазы (МАО). Затем за 10-60 с регистри- а@ руют скорость нарастания биолюмине0ии сценции, по которой судят об активности анализируемого препарата МАО. Измерения проводят на люминометре при

25 С. Скорость выражают в усл.ед/с.

Предварительно в идентичных условиях строят калибровочную зависимость скорости нарастания биолюминесценции от количества в пробе стандартного препарата МАО с известной активностью, измеренной независимым способом, которую используют для выражения активности анализируемого препарата МАО в

Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии.

Цель изобретения — упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют,следующим образом.

В люминометрическую кювету вносят

0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 34-62 мм, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38-66 мм, рН 7,0-7.,5, флавинмононуклеотид (ФМН)

10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН) 0,4-1 мМ, 1521761 4 абсолютных единицах (наномоль субстрата в минуту на мг белка).

Пример 1. В измерительную кювету люминометра вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 62 мМ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38 мМ, рН 7, 0 ФМН 10 мкИ, НЛДН 0,4 мМ, дециламин 5 мкМ, добавляют бактериальную люциферазу в концентрации 10 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из мозга крысы в концентрации 100 мкг/мп. Помещают кювету в люминометр и при 255 С изме15 ряют скорость нарастания биолюминесценции за 10 с, которая составляет

0,31 усл. ед./с. Определенное по калибровочной зависимости значение активности следует умножить на 10 (коэффициент, учитывающий в 10 раз меньшее по сравнению с калибровочнои прямой количество люциферазы, взятое для проведения анализа), что дает моноаминооксидазную активность анализи- 25 руемого препарата митохондрий

10 нмоль/мин на мг белка.

Пример 2. В измерительную кювету люминометра вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 34 мИ, 30 калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный бб мМ, рН 7,5, ФМН 40 мкМ, НАДН 1 мМ, дециламин 50 мкМ, добавляют бактериальную люциферазу 100 мкг/мл и анализируемый препарат тромбоцитов 5 из крови человека в концентрации

100 мкг/мл. Помещают кювету в люминоо метр и при 25 С измеряют скорость нарастания биолюминесценции эа 60 с, которая составляет 0,27 усл.ед./с. По

40 калибровочной зависимости, полученной со стандартным препаратом МАО, определяют моноаминооксидазную активность тромбоцитов из крови человека, которая составляет 0,8 нмоль/мин на мг белка.

Пример 3 ° Все операции выполняют аналогично примеру Т, однако используют водную среду измерения сле". дующего состава: калий фосфорнокислый Я одноэамещенный 45 мИ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 55 мИ, PH 7,2, CNH 10 мкМ, НАДН 1мМ, дециламин 20 мкМ, и в измерительную кювету вносят бактериальную люциферазу

I в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий иэ мозга крысы в концентрации

10 мкг/мл.. Измеренная скорость нарастания биолюминесценции составляет

0.31 усл.ед./с, что соответствует монооксидазной активности 10 нмоль/мин на мг белка.

II р и м е р 4. Все операции проводят аналогично примеру 1, но используют водную среду измерения следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 62 мИ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38 мИ, рН

7,0, ФМН 1 мкМ, НАНП 0,04 мМ, дециламин 0,5 мкМ. В кювету добавляют бактериальную люциферазу в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из мозга крысы в концентрации 100 мкг/мл. Нарастания биолюминесценции наблюдать не удается. Таким образом, выход за диапазон оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси в сторону уменьше-. <: ния делает невозможным определение активности МАО.

Пример 5. Все.операции проводят аналогично примеру 2, но используют концентрации дециламина 400 мкИ, калий-фосфатный буфер 0,1 М, рН 8,0.

Концентрации остальных компонентов оставлены без изменения. Нарастания биолюминесценции не наблюдают.

7аким образом, выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону увеличения делает невозможным определение моноаминооксидазной активности.

Формула изобретения

Способ определения активности моноаминооксидазы путем добавления ферментного препарата моноаминооксидаэы в водную буфернуюреакционную смесь,содержащую субстраты данного фермента, вспомогательный фермент, вызывающий хемилюминесценцию при взаимодействии с продуктами моноаминооксидазной реакции, и субстраты вспомогательного фермента с последующей оценкой активности моноаминооксидазы по скорости нарастания хемилюминесценции о т,— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения, ускорения и повышения чувствительности способа, используют вод ную реакционную смесь, содержащую

0,1 N калий фосфатный буфер рН 7,07,5, флавинмононуклеотид 10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный 0,4-1,0 мИ, дециламин

5-50 мкМ и бактериальную люциферазу

10-100 мкг/мл.