Способ получения биологически активных веществ 55185rp и 59451rp, обладающих иммунодепрессивным действием

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения веществ, являющихся иммунодепрессантами клеточного иммунитета. Для получения веществ 55185RP и 59451RP, представляющих собой циклодепсипептиды, используют штамм STREPTOMYCES SP. CBS N 162.86, выделенный из образца почвы. Штамм культивируют в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях. Культуральную жидкость разделяют, мицелий отделяют и экстрагируют органичесим растворителем. Полученный экстракт разделяют хроматографически и очищают целевые продукты. 1 табл.

г ф

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

0 нн

ОН

1

1

Н

N щ !Х

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 4202611/30 3 (22) 21. 05. 87 (31) 8607269 (32) 22.05.86 (33) FR (46) 07. 01. 90. Бюл. И 1 (71) Рон-Пуленк Санте (FR) (7 2) Морис Де к амп, Франсуа Флош, Жерар Жюнг и Родольф Марграфф (FR) (53) 615.779.9(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ

AKTHBHhIX ВЕЩЕСТВ 55185RP и 59451RP, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОДЕfIPECCHBIIhlM ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии и касается получения веществ, являющихся иммунодепрессантами кле точного иммунитета.

Получаемые вешества 55185 RP u

59451 RP являются циклодепсипептидами общей формулы.80 1535383 A 3 (51) 5 С 2 P 13/00//(С 12 P 3/00, С 12 R 1:465) 2 нологии и касается получения веществ, являющихся иммунодепрессантамн кле- < точного иммунитета. Для получения веществ 55185RP и 59451RP, представляющих собой циклодепсипептиды, используют штамм SCreptomyces sp. CBS

II 162,86, выделенный иэ образца почвы. Штамм культивируют в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях, Культуральную жидкость разделяют, мицелий отделяют и экстрагируют органическим растворителем. Полученный экстракт раз" деляют хроматографически и очищают целевые продукты. 1 табл. где Х вЂ” Cl (вещество 55185 RP) или ф

Н (вещество 5945! RP).

Вещество 55185 RP имеет следующие физико-химические свойства. С

Аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета. Растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, ацето" не, ацетонитриле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, не растворим в воде (0,1-0,3Х в. зависимости от рН), этиловом эфире и гексане.

Найдено, Х: С 58,29; Н 5,30; Cl

3 84 N 10,13; О 22,57 °

С46Н46clN10 f2 Ъ

Вычислено, Х: С 58,47; Н 4,58; (Cl 3,84; N 10,61; 0 22,50.

Т.пл. выше 300 С. Удельное вращение Гс! 1 = +20,5 + 1,4 (с " 0 5 метанол).

1535383

795 пл.

785 ср.

750 ср.

700 ср.

690 пл.

635 о,сл.

625 о.сл.

605 пл.

580 ср.

525 сл.

510 сл.

495 пл.

455 пл.

400 пл.

355 о.сл.

25

Удельное вращение (Ы)д = +24,3й1 (с 0,5, метанол).

УФ-спектр (определен для метанольного раствора 38 мкгlмл при толщине

1 см): смаке 268 нм (Е „ = 223.

E. !9864).

ИК-спектр (определен для таблетки с KBr). Основные полосы поглощения в

ИК-спектре 59451 RP, выраженные в

45 -волновых числах, см- :

УФ-спектр (определение в метанольном растворе 267,5 мкг/мл при

1 А

) 1 27 4 H (Е

2 l 9, E 20 24 0 ) . Наблюдается плечо при 23 0 нм . УФ-спектр не модифицируется при добавлении соляной кислоты .

После добавления щелочи наблюда етс я батохромное смещение с 230 к 24 7 нм и о т 2 7 4 к 29 5 нм .

ИК-спектр (определен для таблетки с KBr), основные полосы поглощения, -1, выраженные в волновых числах, см

3380 о.с. (из них H О)

3300 о.с.

3090 с.л °

3060 сл.

3030 пл, 2980 сл.

2940 сл, 2880 пл.

2700 пл, 2500 пл.

2340 С01

2160 о.сл.

1950 пл.

1880 о.сл.

1740 с.

1680 пл.

1655 о.с.

1625 ср.

1605 ср.

1555.пл.

1529: b. c.

1500 пл.

1455 ср.

1440 пл.

1425 пл.

1405 сл.

1380 сл.

1340 ср.

1310 ср.

1285 сл.

1215 ср.

1205 пл.

1160 с, 1120 пл.

1080 о.сл.

1060 пл.

1050 сл.

1030 о.сл.

1010 пл.

1000 ср.

980 пл..

950 с.л.

925 о.сл.

900 о.сл.

8S0 ср. где о.с. — очень сильная; с — сильная; ср. — средняя; сл. — слабая; о.сл. — очень слабая; пл. — плечо.

Вещество 59451 RP характеризуется следующими физико-химическими веществами.

Аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета. Растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, ацетоне, ацетонитриле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде; не растворим в воводе (0,1-0,3Х в зависимости от рН), этиловом эфире и гексане.

Найдено, Х: С 58,64; Н 5,42; N

10,47; О ?5,10; Н, О 5,37.

С„Н„Н,О „

Иычислено, Х: С 62,09; Н 5,32;

N 11,02; О 21,57.

Т.пл. 275-280 С (разложение). о

3360 пл.

3480 пл, (из них Н О)

3400 о,с.

3280 о. с, 3060 пл.

3040 пл.

2980 сл.

2940 сл.

2880 пл.

2680 пл.

2520 пл.

2160 пл.

2060 пл.

1500 !

1295 !

1!90

330 пл. пл. пл. пл ° пл.

О.с ° о.с. с. с ° с. пл. ср. пл . ср. ср. ср. ср ° пл е пл. оесл ° пл. пл . с. пл.

CPi пл а сл. пл е с. пл. ср. о.сл. пле о.сл. пл е сл. о.сл. о.сл. пл. ср. пл. пле пл. с. с ° пл ° о. сл. о. сл. пл. ср, пл. о.сл. ср. о.сл. о.сл. пл. пл е но

Гидролиз казеина

Гидролиэ желатина

Продуцирование нитратов иэ нит: ратов

Гидролиэ крахмала

Культура на молоке

Отрицательно

Положитель50 но

Пептонизация без коагуляции с подщелачиванием рн, которое проходит от!

535383

55185 RP и 59451 RP могут быть охарактеризованы цветными реакциями с различными реактивами. Они дают положительные реакции с иодом, реакти5 вом Гиббса, сульфированным ванилином, хлорным железом, реактивом Грей-Гибака хлор-толидин и реактивом Эрлиха.

Они дают отрицательные реакции с ингидридом и реактивом Драгендорффа, Микроорганизм, продуцирующий вещества 55185 RP и 59451 RP, представляет собой штамм стрептомицета, который выделен из образца почвы, взятой в Эскандоне. Штамм депонирован в коллекции СВЯ под номером 162.86.

Этот микроорганизм назван Streptomyces вр. S-16328 и характеризуется следующими признаками.

20 Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки. Штамм образует цилиндрические шиповатые споры размером 0,4-0,6; 1 — 1,2 мкм. Прямле или коленчатые споронесущие це25 пи — длинные и чаще всего содержат несколько десятков спор. Спорофиты— прямые. Воздушный спорулированный мицелий бежево-розового цвета. Он хорошо развивается при 28 С. Окраска вегетативного мицелия проходит обычно в зависимости от культуральной среды от желтовато-белого до каштаново-бежевого цвета.

Растворимый пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические свойства.

О

При выращивании при 28 С обладает следующими биохимическими характеристиками.

Продуцированная Отрицательмеланина ное

Продуцирование н s

Тирозиназа

1535383

6,4 до 7,5 за

28 дней.

600

Культивирование осуществляют при

28 С в течение 36 ч при перемешивании о со скоростью 250 об/мин и при аэрации объемом стерильного воздуха с де- 35 битом 5 м /ч.

Продуцирующее культивирование осуществляют в ферментере емкостью 800 л, 0 в которой загружают следующие вещества, кг:

Растворимые стерилизованные продукты от винокурения 10

Стерилизованная церелоза 4

Соевое масло 2 л

Карбонат кальция 2

Стерилизованный

5 сульфат аммония 0,8

Водопроводная вода 400 л рН доводят до 0,7 добавлением

440 см 10 н. раствора гидроксида натрия.

Стерилизуют среду барботированием пара при 122 С в течение 40 мин при

100 С.

p)f среды составляет 6,75.

Культуры на агазированных средах выращивают в чашках Петри, эа исклю- 5 чением сред ISP<, ISP> и меланина о

Ваксмана, при 28 С в течение 2-3 недель. Культуральные свойства штамма представлены в таблице.

Пример 1. Ферментация. В

1О ферментер емкостью 170 л загружают, r:

Пептон 1200

Дрожжевой экстракт

Церелоза

Хлорид натрия

Водопроводная вода (до полного объема) 120 л

Значение рН доводят до 7,0 добавлением 30 см 10 н. раствора гидроксида натрия.

Среду стерилиэуют барботированием пара при 122" С в течение 40 мин. Пос— ле охлаждения рН среды 6,6.

Засевают с помощью 200 см3 куль, туры Streptomyces sp. S 16328 из колбы Эрленмейера при перемешивании в течение 72 ч.

Затем с помощью 40 л инокулирующей культуры в ферментер на 170 с, описанной выше

Культивирование осуществляют при о

26 С в течение 83 ч при перемешивании со скоростью 250 об/мин и при аэрации объемом стерильного воздуха с дебитом 20 м /ч.

По окончании операции рН культуры составляет 8>05, а объем сусла 410 л.

Б. Экстракция — очистка. Фильтруют

400 л ферментационного сусла в присутствии 20 кг добавки для фильтрации на фильтр-прессе. Осадок после фильтрования, содержащий мицелий, разлагают при сильном перемешивании в 200 л ацетона, содержащего 20Х воды. Отфильтровывают на фильтре-прессе в присутствии добавки для фильтрации. Полученный фильтрат концентрируют при пониженном давлении для удаления аце-. тона. Водный остаточный раствор экстрагируют при рН, близком к 7,0, 2 раза 50 л этилацетата. Органическую фазу отделяют декантацией, затем концентрируют досуха при пониженном дasлении (2 в ; 0,27-0,4 кПа). Таким образом получают маслянистый остаток.

Полученный маслянистый остаток обрабатывают 5 л метанола. При перемешивании добавляют 15 л циклогексана.

После декантации метанольную фазу выпаривают при пониженном давлении, и остаток диспергируют в 1 л диэтилового эфира. Образуется мелкий порошок (32,5 г), который отделяют фильтрацией.

Полученный порошок (26 г) обраба3 тывают 500 см метанола и полученныи раствор адсорбируют на 185 r силйкагеля (гранулометрия: 35-70 мкм; пористость 60 А). Сухой порошок загружают в колонну емкостью 400 см, которую

3 заполняют силикагелем. Элюируют с помощью 1 л чистого этилацетата. Из по" лученного раствора после концентрирования досуха получают 11,7 r продукта желтого цвета.

10 r полученного вьппе порошка обз рабзтывают 150 см метанола и полученный раствор адсорбируют на 100 см привитого диоксида кремния (С 18

GRACE: гранулометрия 20 мкм; пористость 100 Л). Полученный сухой порошой загружают в форколонну (диаметр

7,5 см, высота 10 см), затем дополняют привитым диоксидом кремния. Пос9 l 53 ле закрытия форколонны возДух, который она содержит, удаляют потоком ди" стиллированной воды, затем дистиллированную воду заменяют 400 см

40%-ного ацетонитрида.

После этого форколонну соединяют с колонной (диаметр 7,5 см, высота

50 см),содержащей тот же хроматографический носитель, уравновешенный

40%-ным ацетонитрилом. Осуществляют элюирование с дебитом 150 см /мин, собирая фракции по 500 см . Фракции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах из силанизированного оксида кремния МЕРСК, элюируют смесью ацетонитрила с водным

33%-ным раствором хлорида натрия (4060 по объему).

Элюированные продукты различаются по окраске с помощью реактива Эрлиха и их R .

Фракции 12 — 15 содержат 0,46, r продукта, R < которого 0,21, проявляющегося в виде красно †кирпично цвета, и который соответствует 59451 RP.

Фракции 18-55 содержат 5,96 г продукта, R которого 0,14, проявляющегося в виде оранжевого цвета, и который соответствует 55185 RP.

1,13 r продукта, R < которого 0,21, обрабатывают в 15 см- смеси метанола с водой (65:35 по объему). Прозрачный раствор инжсктируют в колонну (диаметр 5 см; длина 50 см) с MCI-гелем CHP 20Р, уравновешенным той же смесью растворителей. Осуществляют градиентное элюирование с дебитом

17 см /мин, собирая 50 фракций по

100 см, затем элюируют смесью метаЪ иола с водой (72: 28 по объему) в тех же условиях. Таким образом получают

60 дополнительных фракций, Фракции 78 †I дают 0,59 r чистого

59451 RP.

10,5 г продукта Р которого 0,14, обрабатывают в 350 см 65%-ного мета3 иола. Прозрачный раствор инжектируют в колонну (диаметр 5 см; длина 50 см) с MCI-гелем CHP 20P, уравновешенным в 65%-ном метаноле. Элюируют в тех

9 же условиях, с дебитом 17 см /мнн, с помощью 14 л 65%-ного метанола, затем с помощью 4 л 85%-ного метанола, собирая фракции по 100 см

Фракции 46-56 дают 9,78 r чистого

55185 RP.

55185 RP « 59451 RP обладают иммунодепрессивными свойствами, а более

5383 1О конкретно является иммунодепрессантами клеточного иммунитета.

Ин витро, в молярных концентрациях

10 — 10 s 55185 RP и 59451 RP ингибируют значительным образом. цитостатическую активность перитонических макрофагов мыши, индуктированных тиогликолятом, и особенно оии стимулируются добавлением 2-интерлейкина к лимфоцитам во время фазы инкубации; продуцирование 2-интерлейкина за счет человеческих лимфоцитов, стимулированных фитогемаглютинином (ФГА) или за счет мышиных тимоцитов, стимулированных ФГА и 1-интерлейкином; продуцирование гамма-интерферона человеческими лимфоцитами или мьппи20 ными тимоцитами.

Ин витро, 55185 RP и 59451 RP не проявляют ингибирующего эффекта в отношении секреции антител и практически не цитотоксичны для клеток лейке25 мии P 388.

Использование способа позволяет получать вещества, обладающие иммунодепрессивным действием.

Формула и э о б р е т е н и я

30 Способ получения биологически ак-, тивных веществ 55185 RP и 59451 RP, обладающих иммунодепрессивным действием, общей формулы

Н0

ОН

Г мн

О

40

t

00 l

Н

NH i i X

45 где Х-Cl (вещество 55185 RP) или H (вещество 59451 RP) заключающийся в том, что штамм Streptomyces sp. CBS

У 162.86 культивируют в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, в глубинныж аэробных условиях, с последующим отделением мицелия, экстракции его органическим растворителем, хроматографическим разделением и очисткой целевых продуктов.

1 35383

Степень развития

Вегетативный мицелий или

Культуральная среда

Растворимый пигмент по отношению к среде

Отсутствует

Отсутствует

Хорошая

I S Р, I S P.

Средняя

1 S Р

1 Б Р

МногочисленБежевый, желтов атый, складчатый

Очень хорошая ные

Бежево-розовый

Отсутствует

Бежевый, сероватый складчатый

Слабая

I S Р

Белов атый о бил ьный складчатый

Достаточно хорошая

Складчатый белый, желтоватый

То же

I S P

Агаризованный меланин ВаксЖелтоватый легкий Отсутствует Отсутствует манна

Плохая

Хлопьевидная бело- -"ватая культура

Агазированная с к азеином

Желтовато-белый

Хорошая до коричнево-желтого обильный и складчатый

Агазированная с тирозином

Белов атый, очень слабое

Желтовато-белый складчатый развитие

Культура на чистом l2X-ном

Отсутствует

Беловатый

Средняя

Хорошая желатине

28 С

Белый малообильный

Желтоватый сегментовидный xopomo развитый

Нитратный питательный бульон Дифко Средняя

Желтовато-белый складчато-обильный

Коричнево-бежевый складчато-обильный

Белый, сероватый

Воздушная сис тема (состояшая из сово» купности воздушного мицелия и споруляции) Беловатый при уровне следов спорО

Отсутствует

Легкий растворимый пигмент коричнево-красный

l535383

Снятое обезжиренное молоко 37 С

Отсутствует

Составитель Г.Смирнова

Редактор В.Петраш Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 58

Тираж 467

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Сегментовидный коричневатый достаточно хорошо развит

l4

Продолжение таблицы